目的:　　 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞(endothelialcells，ECs)的前体细胞，是一群介于血液-血管细胞与成熟内皮细胞之间的具有较强增殖分化能力、可向血管新生部位趋化并促进血管新生的幼稚细胞。在成人，EPCs存在于骨髓，在机体缺血、组织损伤、细胞因子或药物刺激下，可从骨髓向靶部位动员、归巢、分化，形成新生血管，在临床各种缺血性疾病和血管损伤方面有着广泛的应用前景。　　 腰椎间盘退变性疾病因其高发病率和高致残率，严重危害人体健康，造成了沉重的社会负担。椎间盘内无血管组织，其营养来源于经软骨终板和纤维环的渗透作用。终板血供异常可影响椎间盘基质代谢，促使椎间盘退变。将骨髓来源的EPCs移植至腰椎间盘终板周围可能对腰椎间盘退变病人终板下微循环的重建具有重要作用。据文献报道，益气活血化瘀中药可通过改善终板血液循环以增加椎间盘营养供应，调节椎间盘细胞外基质的结构和功能，抑制椎间盘炎症介质，但该类中药如何改善终板血液循环尚未见明确报道。　　 本研究通过建立人骨髓来源EPCs分离、培养、诱导分化与鉴定的方法，筛选出对EPCs数量和功能有促进作用的中药活性成分，并探讨其作用机制，为腰椎间盘退变性疾病的发病机理及其预防治疗的研究提供实验基础。　　 方法:　　 1.人骨髓来源EPCs的分离、培养、鉴定　　 采用Ficoll密度梯度离心法，分离腰椎间盘退变性疾病患者骨髓中的单个核细胞，以3 x106/cm2/密度接种于预先包被人纤维连接蛋白的25cm2培养瓶中，72h后换液，洗去非贴壁细胞，此后每3d换液一次。培养至第7d的细胞作Dil-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色，并用流式细胞仪分析细胞表面CD133、CD34、VEGFR-2、VE-cadherin、E-selectin、vWF的表达情况，透射电镜观察胞质内Weibel-Palade小体的分布，体外血管生成实验检测EPCs的管腔形成能力。　　 2.活血化瘀中药活性成分对EPCs数量和功能的影响　　 取培养7-10d的EPCs用于研究，随机分为两组：正常对照组和药物干预组。不同浓度的药物活性成分银杏内酯B、西红花苷-Ⅰ、二氢欧山芹醇当归酸酯、薯蓣皂苷分别孵育EPCs48h后，采用WST-8比色法、Transwell小室法、粘附能力测定实验、体外血管生成实验检测细胞增殖能力、迁移能力、粘附能力、管腔形成能力。　　 3.银杏内酯B对H2O2诱导的EPCs的氧化损伤的保护作用及促进EPCs数量和功能的机制研究　　 向银杏内酯B预先孵育24h的EPCs中加入150μMH2O2，未加药物孵育的EPCs作为空白对照组，作用6h后，WST-8比色法检测细胞增殖情况，AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡比例。　　 应用PI3K特异性抑制剂LY294002和Wortmannin以及Erk特异性抑制剂PD98059干预EPCs后，观察其增殖情况。蛋白印迹法测定药物干预对EPCs中磷酸化蛋白Akt、eNOS表达的影响，实时荧光定量法观察药物干预对EPCs中mRNAeNOS、KDR表达水平的影响。统计方法采用配对t检验，独立样本的T检验，单因素方差分析，用SPSS16.0统计软件完成，P＜0.05视为具有统计学意义。　　 结果:　　 1.人骨髓来源EPCs的分离、培养、鉴定　　 原代细胞培养5d左右始见细胞集落形成，至第7d，细胞体积变大，细胞伸展呈纺锤形。可摄取Dil-ac-LDL并与FITC-UEA-Ⅰ结合。培养至第7d的细胞部分表达CD133、CD34、KDR，至第14d细胞表面CD133表达率下降，而相应成熟内皮细胞抗原KDR、VE-cadherin、E-selectin、vWF表达增加。透射电镜结果显示培养第10d的EPCs在细胞质内含有血管内皮细胞所特有的Weibel-Palade小体。培养第7-12d的EPCs接种于ECMatrix上，12h可形成管腔样结构。　　 2.活血化瘀类中药活性成分对EPCs数量和功能的影响　　 不同浓度银杏内酯B与EPCs培养48 h能较对照组明显提高EPCs数量，显著改善其迁移、黏附、体外血管形成能力；不同浓度西红花苷-Ⅰ作用48h后，5μg/mL、50μg/mL西红花苷-Ⅰ可明显促进EPC增殖，改善EPCs的粘附能力和迁移能力；不同浓度二氢欧山芹醇当归酸酯作用48h后，可明显促进EPCs增殖(P＜0.05)，呈浓度依赖性，但对细胞的迁移能力无明显影响；不同浓度薯蓣皂苷作用24、48h后，对EPCs的增殖能力无影响。　　 3.银杏内酯B对H2O2诱导的EPCs的氧化损伤的保护作用及促进EPCs数量和功能的机制研究　　 不同浓度银杏内酯B能显著提高细胞存活率，并有效减少H2O2诱导的细胞凋亡。不同浓度MAPK/ERK-1、Akt信号通路抑制剂PD98059、LY294002、Wortmaning与EPCs作用48h，未降低细胞活性。上述信号通路抑制剂对80μg/mI银杏内酯B诱导的EPCs的增殖有抑制作用，其中1μMPD98059及10μM、100μMPD98059、LY294002、 Wortmaning与对照组比较有显著差异。银杏内酯B提高了EPCs中Akt、eNOS的蛋白表达和eNOS、KDR的mRNA表达，且呈一定的浓度依赖性。　　 结论:　　 采用密度梯度离心与贴壁培养法分离、培养的人骨髓来源的单个核细胞，通过特定诱导条件下可分化为EPCs。活血化瘀类中药活性成分银杏内酯B可促进EPCs增殖，增强细胞功能；西红花苷-Ⅰ和二氢欧山芹醇当归酸酯在一定浓度范围内促进EPCs增殖并部分增强细胞功能，薯蓣皂苷对EPCs增殖能力无影响。其中银杏内酯B还具有抗氧化损伤作用，并且其促增殖和细胞功能的作用可能是通过PI3K和MAPK两条信号转导通路实现。