论文部分内容阅读
人乳头瘤病毒(HPV)可引起人类多种良恶性疾患。HPV16、18等高危型由于和宫颈癌等多种恶性肿瘤关系密切，研究较为深入；HPV6、11等低危型是引起尖锐湿疣与呼吸道乳头瘤病的主要病原，随着发病率的增加近年来也日益受到重视。HPV由于生活周期对上皮分化严格依赖，不能在常规的细胞培养体系中传代扩增，长期以来阻碍着人们对其研究的深入；而近年来组织培养与分子生物学技术的进步则为HPV的细胞模型研究注入了新的内容与可能性。本研究选择低危型HPV6、11为研究对象，以人永生化角质形成细胞HaCaT作为宿主细胞，通过转染及感染方式获取携带有HPVDNA的阳性细胞，并对相关感染标志进行检测，旨在在HPV体外研究领域进行初步尝试，为下一步HPV体外药效评价模型的建立及药物抗HPV活性的检测打下基础。全文具体分为两部分。
第一部分HPV11基因组DNA对HaCaT细胞的转染与检测目的探讨应用转染与筛选技术获取稳定携带有HPV11基因组DNA的细胞的可能性；探索合适的HPV感染检测指标与方法。
方法对含有pBR322.HPV11质粒的大肠杆菌培养扩增，然后进行质粒的提取与纯化，并用限制性内切酶BamHI切割下HPV11全长基因；低熔点琼脂糖回收后，用T4DNA连接酶进行线状DNA的自身环化，再与PTK-neo质粒按比例混合，以Lipofectamine试剂共转染HaCaT细胞；最后通过G418筛选而得到阳性细胞克隆。将阳性克隆细胞合并与培养扩增后，用FQ-PCR及PRINS技术检测所得细胞内HPV11DNA的存在，用巢式RT-PCR技术检测HPV11E1＾4mRNA的表达，用免疫组化技术检测HPV衣壳抗原的表达。
结果G418筛选约两周后，培养皿内即可见到对G418抵抗的阳性细胞克隆出现，其形态与普通HaCaT细胞无区别。FQ-PCR与PRINS方法均可在筛选后的HaCaT细胞中检测到HPV11DNA的存在。RT-PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳可检测到特异性的628bp阳性条带。免疫组化染色未检测到HPV衣壳抗原表达。
结论HPV11基因组DNA可通过脂质体转染法成功导入HaCaT细胞内，通过筛选可以获得稳定性及阳性率较高的阳性细胞。HPV11的DNA与mRNA均可作为感染标志并可通过多种方法检测；但在单层培养中HPV衣壳抗原不表达，不宜作为检测指标。
第二部分HPV6/11型病毒颗粒对HaCaT细胞的感染与检测目的探讨HPV6/11型病毒颗粒体外感染HaCaT细胞的可能性及感染条件；并对相关感染指标进行检测。
方法从临床尖锐湿疣标本中分离提取HPV病毒颗粒，通过型特异性PCR明确为HPV6/11；再以之实验性感染单层培养的HaCaT细胞。以FQ-PCR技术监测病毒悬液与感染后HaCaT细胞的病毒DNA载量；用PRINS方法原位检测感染后HaCaT细胞中HPVDNA的存在及分布；以免疫组化法检测HPV的衣壳抗原表达。
结果在本研究所采取的感染条件下，当病毒悬液中HPVDNA达到105拷贝/ml以上时，病毒处理后的HaCaT细胞FQ-PCR检测结果呈稳定阳性；PRINS方法可检测到胞核阳性染色的细胞存在；免疫组化法未能检测到HPV衣壳蛋白的表达。
结论临床尖锐湿疣组织中提取的HPV6/11病毒颗粒可以在实验条件下感染HaCaT细胞，但对病毒浓度及具体感染条件有一定要求。在感染细胞核内可检测到HPVDNA存在，但无衣壳蛋白表达。