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仙台病毒是人畜共患致病源之一。近年来,仙台病毒对实验动物和人的危害越来越为人们关注,检测和预防仙台病毒成为病毒研究者的重要任务之一。
利用病毒重要的抗原作为间接抗原诊断和免疫病毒宿主是预防病毒流行的重要方法。抗原多是病毒编码的自身结构蛋白,因此,本实验依据仙台病毒N基因抗原性与反应原性的特点,对N基因进行克隆,构建出昆虫杆状病毒N基因重组表达载体,表达出具有生物活性的重组蛋白,为检测仙台病毒和免疫动物提供基础。
本研究先在鸡胚中传代繁殖适量的仙台病毒,提取纯化后,以病毒基因组RNA做模版,经RT-PCR扩增仙台病毒N基因,将其克隆至pMD18-T中命名pMD18-T-N并测序。测序基因经过PCR扩增被定向克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBacHTb中,筛选正确重组质粒命名pFastBacHTb-N。测序鉴定后,pFastBacHTb-N转化入含杆状病毒感受态细菌DH10BAC,通过Ecoli自身较低概率的同源重组,蓝白斑筛选插入目的片段的杆状病毒,命名rBacmid-N。rBacmid-N经过转染生长状态良好的昆虫细胞,收毒接毒2-3代SDS-PAGE检测蛋白表达条带,表达的特异性条带进行weston blot分析及与标准血清ELISA反应,确定所表达的重组N蛋白生物活性。
测序结果显示,得到约1.6kb的N基因,该基因与其它仙台病毒株核酸序列相比有一定的无义突变,但序列编码肽链高度同源;提取重组病毒DNA,经PCR鉴定目的片段已经插入杆状病毒基因组中。rBacmid-N转染sf9昆虫细胞,昆虫细胞病变明显。SDS-PAGE电泳可见一条大小约60kD的特异性条带,与预期一致。Western blot实验结果显示重组蛋白具有良好的抗原性。与标准血清ELISA反应结果表明N基因有较好的反应原性,适宜做间接抗原。
本实验成功获得仙台病毒N基因,构建了N基因昆虫杆状病毒N重组表达载体,并在昆虫细胞中表达了有生物活性的重组N蛋白,为利用N作间接抗原诊断仙台病毒及其作为免疫抗原奠定了基础。