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谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase）是一种酰基转移酶,能催化蛋白质分子间的交联反应,在食品、制药和纺织等领域具有广泛的应用前景。研究室前期工作中构建了表达茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）TGase酶原（pro-TGase）的重组菌——解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1h/hpro-TGase。为提高活性TGase生产效率,本文以Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase为对象,优化了pro-TGase在5 L罐上的发酵条件,构建了TGase活化蛋白酶（TAMEP）生产菌并对TAMEP进行固定化,实现了TGase的高效发酵和活化。主要研究结果如下:（1）Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase的发酵优化在5L罐中,依次考察了搅拌转速、pH控制和甘油补料对Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase发酵的影响,采用dispase活化后测定pro-TGase对应TGase活力。搅拌转速优化显示,低转速（600 rpm和700 rpm）较高转速（800 rpm和900 rpm）在80 h小时后获得的pro-TGase表达量更高;发酵120 h,600 rpm获得pro-TGase产量达到6.8 U·mL-1,较900 rpm提高45%。重组菌在甘油耗尽后pH升高,pro-TGase开始表达。故考察pH回升阶段控制pH为5～8,对pro-TGase发酵的影响。结果表明,控制pH 7时pro-TGase产量达到17.4 U·mL-1,较不控制pH提高156%。为提高菌体浓度,待培养基中甘油耗尽后,进行10～40 g·L-1的甘油补料。结果显示,10、20、30、40 g·L-1甘油补料较分批发酵的细胞浓度分别提高35%、83%、107%、142%,但pro-TGase产量分别下降17%、34%、25%、32%。最终确定5 L罐分批发酵发酵条件为:搅拌转速为600 rpm、pH回升阶段控制pH 7,发酵120 h。（2）TAMEP在E.coli BL21（DE3）中的表达及酶学性质分析为制备pro-TGase活化蛋白酶,将S.mobaraensis来源的TAMEP分泌表达于E.coli BL21（DE3）。信号肽优化显示,TAMEP天然信号肽介导的胞外TAMEP较pelB信号肽提高92.6%。对TAMEP天然信号肽的N端前10个氨基酸进行随机同义突变,筛选到一株TAMEP表达量高30%的突变株。通过单因素优化,最终确定该菌株高效分泌表达TAMEP的条件为:诱导温度20℃、IPTG浓度为10μM、诱导起始OD600=1.5及添加1.0%葡萄糖。在此条件下,胞外TAMEP酶活力达到186.3 U·mL-1,较优化前提高5.9倍。胞外TAMEP经镍柱亲和纯化,比酶活力达到437 U·mg-1。酶学性质分析显示,TAMEP最适反应温度和最适反应pH分别为55℃和7.0;TAMEP在30-50℃孵育1 h酶活残余50%,而在60℃下孵育1 h酶活完全丧失;TAMEP在碱性环境中较在酸性环境中更稳定。上述性质与天然S.mobaraensis TAMEP性质接近。活化反应分析表明,0.133μM TAMEP能使6.91μM pro-TGase在10 min内基本转化为活性TGase,且不会持续降解活化后的TGase。（3）TAMEP固定化及其催化pro-TGase活化的条件优化以戊二醛为交联剂将TAMEP固定化至壳聚糖小球。考查了戊二醛浓度（1-4%）、壳聚糖活化时间（10-240 min）、TAMEP浓度（1.77～14.17μM）及其交联时间（8～48 h）对固定化的影响。确定TAMEP固定化条件为:1%（v/v）戊二醛,壳聚糖活化3 h,10.63μM TAMEP,TAMEP交联8 h。在该条件下,TAMEP固定化率、酶活收率及与固定化酶比活力分别达到76.0%、36%、42.6 U·g-1。与游离的TAMEP相比,固定化TAMEP在50和60℃下孵育1 h后的残余酶活分别提高26%和19.3%;在pH为5和10的环境下孵育1 h,残余酶活分别提高39.7%和14.7%。上述结果表明,固定化TAMEP较游离的TAMEP具有更高的热稳定性和pH稳定性。此外,固定化使TAMEP的最适反应pH由7变为9。TGase酶原活化分析显示,10颗固定化TAMEP小球在37℃下反应10 min能完全活化1.40 U TGase,且重复反应10次后仍能保持75%的酶活。