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目的:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）全球广泛流行,造成了极大的健康和经济负担。CKD引起的矿物质代谢紊乱和骨病（CKD-mineral and bone disorder,CKD-MBD）可导致血管中膜钙化和骨代谢异常,是CKD患者全因和心血管死亡的重要原因。高磷环境下血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的表型转换是中膜钙化的重要病理生理学基础。自噬对维持VSMCs内环境稳定和应对外界刺激有重要作用,且自噬可缓解高磷诱导的VSMCs钙化。锌是人体中常见的微量元素,对许多大分子及酶的结构和功能至关重要,是细胞多种生命活动的基础。锌转运体、锌受体及锌结合蛋白共同维持细胞内锌稳态。大量动物模型及临床研究表明,锌稳态异常可促进机体炎症、氧化应激,并干预凋亡等病理生理过程。此外,锌还参与健康骨骼的生长和维持,正常的血锌水平和饮食锌摄入对预防骨质疏松有重要作用。许多体外实验表明,锌可正向调控自噬并发挥对细胞的保护作用。其中,细胞外调节激酶（Extracellular regulatory kinase1/2,ERK1/2）信号通路被证实和锌调控自噬密切相关。目前尚无关于补锌是否可抑制血管钙化并改善骨代谢紊乱的CKD动物研究。并且锌及锌转运体对血管钙化及自噬的调控作用及机制也未见报道。本研究旨在1)通过体内实验探索补锌对CKD大鼠的矿物质代谢、血管钙化及骨代谢的作用及自噬水平的影响;2)通过构建高磷诱导的VSMCs体外钙化模型探索锌影响自噬并抑制钙化的机制;3)探索VSMCs不同钙化阶段锌转运体的水平变化及锌转运体对钙化及自噬的影响。研究方法:1.锌对CKD大鼠CKD-MBD及自噬影响的研究:通过0.25%腺嘌呤/低维生素K饲喂Wistar大鼠构建CKD模型。将大鼠随机分为6组:CTR（对照组）;CTR+ZH（锌对照组,60mg/kg Zn Cl2）;CKD（钙化组）;CKD+ZL（钙化+低剂量锌组,5mg/kg Zn Cl2）;CKD+ZM（钙化+中剂量锌组,30mg/kg Zn Cl2）;CKD+ZH（钙化+高剂量锌组,60mg/kg Zn Cl2）。Zn Cl2根据大鼠体重每隔1日进行灌胃。收集大鼠基线和诱导模型开始后的每2周的尿液及血液,分析体重及血肌酐（SCr）、血钙（SCa）、血磷（SP）、血锌（SZn）、血碱性磷酸酶（ALP）、血甲状旁腺激素（PTH）、尿磷（UP）、尿钙（UCa）等生化指标。3个月后处死大鼠,收集主动脉行茜素红染色及钙定量以检测血管组织钙化情况,行免疫组化和Western Blot以检测血管组织平滑肌标志物α-SMA、成骨蛋白RUNX2、自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I的表达水平;收集双侧股骨行Micro-CT、Goldner染色及TRAP染色分析骨组织形态学参数。2.ERK1/2信号通路在锌调节高磷诱导的VSMCs自噬及钙化的研究:使用CCK-8检测不同锌浓度（10～80u M Zn Cl2）对人主动脉平滑肌细胞（Human aortic smooth muscle cells,h ASMCs）生存活力的影响并使用β-甘油磷酸（β-glycerophosphate,β-GP）构建h ASMCs钙化模型。采用茜素红染色、Western Blot在合适范围内探索不同锌浓度对h ASMCs钙化及成骨转分化的影响。选取最佳的锌干预浓度并利用免疫荧光检测h ASMCs内LC3表达,Western Blot检测LC3II/LC3I、Beclin1表达,透射电镜观察h ASMCs内自噬体数量。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）检测锌是否可通过激活自噬缓解h ASMCs钙化。采用ERK1/2通路抑制剂（U0126）检测锌是否可通过激活ERK1/2信号通路促进自噬,缓解β-GP诱导的h ASMCs钙化。3.锌转运体对β-GP的VSMCs钙化及自噬的研究:利用q RT-PCR技术检测锌对h ASMCs钙化不同阶段（2d、7d、14d）的锌转运体（ZIP1～14）表达的影响,采用脂质体转染法对h ASMCs进行转染,应用茜素红染色、钙定量分析、Western Blot、免疫荧光等技术检测锌及ZIP13对β-GP诱导的h ASMCs钙化及自噬的影响。结果:1.锌对CKD大鼠体重、血清生化和尿生化的影响:相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组体重、SCa、UP水平下降,SCr、SP、ALP、PTH、UCa水平升高;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组SCa、ALP、UP水平上升,SCr、SP、PTH、UCa水平下降。各组SZn水平未间明显差异。2.锌对CKD大鼠主动脉钙化的影响:茜素红染色显示,相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组主动脉壁存在不同程度的橘红色钙沉积;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组钙沉积减少,呈剂量依赖关系。主动脉钙定量、免疫组化染色及Western Blot检测结果显示,相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组主动脉壁钙沉积增加,α-SMA表达下降,RUNX2表达升高;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组钙沉积减少,α-SMA表达升高,RUNX2表达下降,呈剂量依赖关系。3.锌对CKD大鼠主动脉自噬的影响:免疫组化染色及Western Blot检测结果显示,相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组主动脉LC3II/LC3I、Beclin1表达升高;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组LC3II/LC3I、Beclin1表达升高,呈剂量依赖关系。4.锌对CKD大鼠骨代谢的影响:骨Micro-CT结果显示,相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组骨体积比值（BV/TV）、骨面积比值（BS/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁密度（Tb.BMD）、皮质骨总面积（Tt.Ar）、皮质骨面积（Ct.Ar）、皮质骨面积比值（Ct.Ar/Tt.Ar）、皮质骨厚度（Ct.Th）下降,骨小梁分离度（Tb.Sp）、皮质骨孔隙率（Ct.Po）升高、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨皮质密度（Ct.BMD）未见明显差异;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.BMD、Tt.Ar、Ct.Ar、Ct.Ar/Tt.Ar升高,Tb.Sp下降,Tb.Th、Ct.Th、Ct.BMD未间明显差异。骨Goldner染色及TRAP染色显示相较于CTR和CTR+ZH组,CKD、CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组类骨质面积/骨面积（OS/BS）、类骨质宽度（Ow）、破骨细胞面积/骨面积（OC.S/BS）升高,矿化骨体积（MLV）减少;相较于CKD组,CKD+ZL、CKD+ZM、CKD+ZH组,MLV、OS/BS、Ow升高,OC.S/BS下降。5.锌对β-GP诱导的h ASMCs钙化的影响:CCK-8结果显示10～40u M的锌对h ASMCs活性无影响。茜素红染色及Western Blot结果显示10～40u M的锌可减少高磷环境中h ASMCs的钙结节、钙含量、RUNX2表达,增加α-SMA表达,且30u M的锌对钙化显示出最佳的抑制效果。6.锌对β-GP诱导的h ASMCs自噬及钙化的影响:Western Blot结果显示,30u M的锌可进一步促进高磷环境下h ASMCs自噬蛋白的表达,使用3-MA预处理后,高磷环境下h ASMCs的LC3II/I、Beclin1表达下降,胞质内LC3荧光聚集减少,自噬体数量减少,钙结节、钙含量、RUNX2表达升高,α-SMA表达下降。7.ERK1/2信号通路对锌调节β-GP诱导的h ASMCs自噬及钙化的影响:30u M的锌可促进高磷环境下h ASMCs磷酸化的ERK1/2蛋白表达,使用U0126处理后,锌无法减少β-GP诱导的h ASMCs的钙结节、钙含量,且磷酸化的ERK1/2、α-SMA、LC3II/I、Beclin1表达下降,RUNX2表达升高,胞质内LC3荧光聚集减少,自噬体数量减少。8.锌转运体对β-GP诱导的h ASMCs钙化及自噬的影响:β-GP可降低h ASMCs中ZIP13的表达,30u M的锌可促进高磷环境下h ASMCs中ZIP13的表达;ZIP13基因沉默可减少β-GP诱导的h ASMCs钙结节、钙含量、RUNX2表达,增加α-SMA表达,但LC3II/I、Beclin1表达减少,LC3荧光聚集减少。结论:1.锌可改善CKD-MBD,在抑制血管钙化的同时也可改善骨代谢紊乱。2.锌可激活自噬并可通过激活自噬抑制血管钙化。3.ERK1/2信号通路参与锌对高磷环境下h ASMCs自噬的调节,锌可通过激活ERK1/2信号通路增强自噬,抑制血管钙化。4.ZIP13基因沉默可抑制h ASMCs钙化,但减少了β-GP和锌诱导的自噬。