桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属于双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一种在世界范围内广泛分布的重要农业害虫。桔小实蝇成虫产卵于果皮内,幼虫孵化后在果实内取食危害,严重降低果实经济和食用价值；加之其成虫寄主范围广、适应性和繁殖力以及扩散能力强等特点,该虫被许多国家列为检疫对象,成为国际贸易的技术壁垒。与其他昆虫一样,桔小实蝇不能依赖自身物质从头合成蜕皮激素,只能是将其取食获得的植物甾醇或动物胆固醇进行一系列相应的代谢而产生。负责该过程的是一类名为‘’Halloween gene"的P450多功能氧化酶,将植物甾醇最终氧化成为最具生物活性的20-羟基蜕皮酮(20E),调控昆虫胚胎发育、幼虫生长与变态、蛹期形态建成以及成虫交配繁殖等整个过程。合成的20E可诱导蜕皮激素受体EcR表达,当EcR达到一定阈值后,与其配体USP形成功能性的EcR/USP异二聚体。随后,再与20E进行结合,形成20E-EcR/USP复合体,起始20E信号传递,并介导产生一系列早期和晚期级联反应,最终影响细胞的增殖、分化,甚至程序性死亡。随着RNAi技术的出现与成熟,基因功能的研究进入一个崭新的阶段。借助该技术,可以重新发现基因新功能、探索未知基因功能,是生物反应、药物筛选、疾病治疗、害虫防治等研究的有力手段,极大地加快了分子生物学研究步伐,具有广阔的应用前景。本学位论文以柑桔重要害虫桔小实蝇为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路基因全长序列,对其特征序列进行注释并确定其系统发育关系；在此基础上运用qPCR技术分析这些基因在桔小实蝇胚后发育各阶段和幼虫不同组织中的表达及分布情况；同时,结合生测试验,明确幼虫在饥饿胁迫条件下的生物学变化和上述基因转录水平情况,明确桔小实蝇的应激响应机制,为其综合防治提供依据。昆虫生长发育是受激素严格控制的过程,在农业生产中常用激素类似物质来干扰害虫的正常生长,从而达到控害的目的。因此,本研究还利用微量注射技术,研究外源20E对桔小实蝇幼虫发育、变态及蜕皮激素合成和信号通路基因表达的影响。最后,利用RNAi技术明确桔小实蝇蜕皮激素受体BdEcR-B1在幼虫阶段的20E信号传导中的作用。加深桔小实蝇变态发育的分子调节和作用机制的研究,尤其是对蜕皮激素合成和信号传导通路对其发育变态的分子调控模式,及其在逆境胁迫条件下的应激响应机制,将有助于明确各基因在通路中的功能及其调节方式,为转基因技术在害虫控制中的应用提供潜在作用靶标,同时为新型农药开发提供理论依据。本研究主要研究结果如下：1桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因克隆与序列分析基于对桔小实蝇转录组数据分析的基础上,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路上7个基因的cDNA全长序列,并完成在GenBank登录,其基因名称和登录号分别为BdCyp302α1(JQ027284)、 BdCyp315α1(KC515377)、BdCyp314α1(JQ229645)、BdEcR-B1(JQ034623)、 BdE75(KC515378)、BdL63(KC515379)和BdTaiman (JQ266268)。利用分子生物学软件对上述基因进行分析,明确其开放阅读框ORF、氨基酸序列、理化性质、跨膜结构域等,并对其保守结构域进行了鉴定和详细注释。分析发现,桔小实蝇蜕皮激素合成通路基因BdCyp302α1、BdCyp315α1和BdCyp314α1均属于"Halloween"基因家族,具有细胞色素氧化酶P450所特有签名序列：Helix-I、 Helix-K、底物识别性位点和血红蛋白结合位点等结构。桔小实蝇的BdCyp302α1和BdCyp314α1属于线粒体型,而BdCyp315α1属于微粒体细胞色素氧化酶。在蜕皮激素信号通路基因的研究中发现,桔小实蝇BdEcR-B1具有典型核受体保守结构域和微结构域,如DNA结合域和配体结构域等结构,双翅目昆虫EcR-B1亚型所特有的K/RRRW、S-rich、DL-rich、EESST/SEVV/TSS等特征基序。与BdEcR-B1相同,BdE75同属于核受体基因家族,具有其典型的配体结合域以及DNA结合域,其内含量2个C4锌指结构,在蜕皮激素信号通路上起初级响应元件的作用。BdL63序列N端具有cyclin-dependent kinase结构。BdTaiman属于p160核受体共激活子家族,具有basic helix-loop-helix (bHLH)结构域及乙酰化典型结构基序LxxLL。2桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因的表达模式分析2.1桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因在不同发育阶段的表达模式在成功建立桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因的qPCR反应体系的基础上,以a-Tubulin为内参基因,分别对桔小实蝇蜕皮激素合成通路(BdNvd、 BdCyp306α1、BdCyp302α1、BdCyp315α1和BdCyp314α1)和信号通路(BdEcR-B1、 BdUSP、BdE75、BdL63、BdTaiman)基因在其不同发育阶段(幼虫、蛹和雌成虫),共25个时间点的表达情况进行了分析。桔小实蝇蜕皮激素合成通路基因在不同日龄幼虫中的表达模式较为相似,BdNvd、BdCyp302α1、BdCyp314α1基因的最高表达量均出现在末龄幼虫阶段,与即将出现的化蛹行为有关。在蛹期,与BdNvd在蛹末期高表达不同,BdCyp306α1、 BdCyp302α1和BdCyp315α1基因相对最高表达量出现在化蛹初期,并随着蛹日龄的增加而显著地降低；BdCyp314α1则在蛹期呈现3个表达高峰,可能与20E介导的组织重建过程相关。在成虫期,除BdCyp314α1外,桔小实蝇蜕皮激素合成通路基因的最低表达量均出现在羽化初期,在第7日龄中出现显著性升高,并随即下降后再次上升,并在第19日龄成虫中达到相对表达量的最大值,表明蜕皮激素合成通路基因的表达与其性成熟和产卵行为有关。就蜕皮激素信号通路基因而言,BdEcR-B1、BdUSP、BdL63和BdTaiman的表达量在末龄幼虫阶段均出现上升,暗示这些基因可能与蜕皮激素介导的变态反应有关。BdE75在蛹中期特异性高表达,可能在组织重建中具有重要作用。其余基因在蛹中后期表达模式比较相似,呈现逐渐下降的趋势,暗示由20E调控的组织重建过程也趋于完成。在成虫期,BdEcR-B1和BdE75基因的相对表达量随日龄的增加而出现上升；BdUSP和BdL63基因的相对表达量在前16日中保持相对稳定,在第19日龄出现明显的上升；而BdTaiman基因的相对最高表达量出现在雌虫羽化的第1天,并在随后的阶段保持相对稳定,推测上述基因在雌虫卵巢成熟过程中起不同作用。2.2桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因在不同组织的表达模式同样以a-Tubulin为内参基因,对上述基因在桔小实蝇5日龄幼虫前胸腺(复合体)、脂肪体、中肠、马氏管、表皮和气管的mRNA的表达水平进行了评价。结果发现,前胸腺仍为蜕皮激素早期合成的主要场所。BdNvd、BdCyp306α1和BdCyp315α1基因在前胸腺中特异性高表达,极显著高于脂肪体、中肠、马氏管、表皮和气管,而这些组织内的表达量无显著性差异。BdCyp302α1基因在脂肪体、前胸腺、马氏管／表皮、中肠／气管中的表达量逐步降低。而BdCyp314α1基因在中肠、马氏管、脂肪体中的相对表达量依次降低,但均显著性高于表皮、气管和前胸腺。说明桔小实蝇不同组织均参与蜕皮激素的合成,前胸腺、脂肪体和中肠是20E合成的主要场所：此外,马氏管除主要负责排泄外,也参与了蜕皮激素的合成。在桔小实蝇蜕皮激素信号通路基因的研究中发现,BdEcR-B1和BdE75的表达模式较为相似,在脂肪体的表达量极显著高于其余5个组织,且在5个组织内无显著性差异；其中,BdE75在脂肪体内特异性高表达,其表达量是表皮的122倍。BdUSP在前胸腺表达量与脂肪体无显著性差异,但均极显著高于其他4个组织。而BdL63的表达量在脂肪体、前胸腺和马氏管中依次降低,而在马氏管、中肠和表皮中无显著性差异。BdTaiman基因在马氏管中的表达量显著性高于表皮,但与前胸腺、脂肪体和中肠差异不显著。综上,蜕皮激素信号通路基因主要集中在脂肪体内表达,由此推测,这可能与脂肪体营养储存和能量代谢功能相关。3饥饿对桔小实蝇幼虫发育和蜕皮激素合成与信号通路基因的影响3.1饥饿对桔小实蝇幼虫发育的影响对桔小实蝇5日龄幼虫进行不同时长饥饿处理后发现,饥饿有效缩短幼虫历期,造成提前化蛹,且蛹体较小的现象,但并未引起幼虫存活率的降低,说明桔小实蝇在末龄幼虫的第1天,已经达到其化蛹所需最低体重阈值；在食物不足的情况下,通过提前变态成小个体蛹,来避免外界不利环境对自身的影响,维持种群延续。3.2桔小实蝇蜕皮激素合成信号通路基因在饥饿胁迫下的表达模式利用实时定量荧光PCR检测发现,其蜕皮激素合成通路基因表达水平在饥饿处理后出现明显的变化。BdNvd、BdCyp302α1和BdCyp314α1基因的相对表达量在饥饿胁迫6h后即出现显著性上调,其中BdCyp302α1和BdCyp314α1基因在24h达到极显著上调水平：而饥饿后48h后,BdNvd、BdCyp302α1和BdCyp314α1的表达水平出现显著性降低。对信号通路基因的研究发现,除BdL63外,其余各基因表达均出现显著性上调。由此推测,桔小实蝇幼虫在食物缺乏的状况下,可能通过提高蜕皮激素合成和信号通路基因的转录水平使体内蜕皮激素含量升高,信号传导加强,导致其幼虫提前化蛹,从而避免不良环境的胁迫。4外源20E对桔小实蝇幼虫发育和蜕皮激素合成与信号通路基因的影响4.1外源20E对桔小实蝇幼虫发育的影响利用微量注射法,观察不同剂量20E处理对桔小实蝇幼虫发育的影响。结果发现,注射激素后,幼虫化蛹时间提前。同时,化蛹过程出现异常,并出现头部缢缩、黑化以及幼虫形态蛹的现象,且畸形的蛹宽和蛹长出现变化。畸形率和蛹死亡率显著上升。说明外源激素干扰了桔小实蝇幼虫正常生长发育和变态过程。4.2外源20E对桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因的影响经0.1μg/头剂量处理后,桔小实蝇蜕皮激素合成通路基因BdNvd、 BdCyp306α1、BdCyp302α1和BdCyp315α1均表现出相似的诱导反应,其相对表达量出现极显著上调,而BdCyp314α1的表达却被外源激素所抑制。桔小实蝇蜕皮激素信号通路基因的表达也表现出类似的诱导效应。除BdEcR-B1仅在处理1h后出现极显著的下调外,其它基因较对照而言,均出现极显著的上调。经0.1和1.0μg/头外源20E处理后,BdNvd、BdCyp306α1和BdCyp315α1的表达量均极显著高于对照组；BdCyp302α1的表达量仅在0.1μg/头的剂量处理下极显著性高于对照组；而BdCyp314α1的表达量在0.5和1.0μg/头处理组的表达量均显著性低于对照。此外,BdEcR-B1和BdUSP均出现极显著上调。BdE75和BdL63对20E处理的反应较为一致,均在0.1μg和1.0μg/头处理后出现极显著性的上调。但0.5μg/头处理对蜕皮激素合成和信号通路基因的表达均表现出不同程度的抑制作用,该剂量可能是桔小实蝇体内某些生理反应的一个阈值,影响其生长发育等重要过程。5桔小实蝇BdEcR-B1基因的功能研究通过体外转录法获得高质量dsRNA,借助微量注射技术将外源dsRNA导入桔小实蝇5日龄幼虫体内。qPCR分析结果表明,BdEcR-B1基因表达量在注射72h后出现明显的下调,其表达量仅为对照组的53.4%。对桔小实蝇蜕皮激素信号通路基因的相对表达量进行分析发现,在靶基因沉默后,BdUSP和BdTaiman基因相对表达量出现了显著性下调,其中BdTaiman基因相对表达量在注射24-72h后出现极显著的下调,仅为对照组的9.7-12.5%。而BdE75基因和BdL63基因的转录并未受影响,出现2倍左右的上调。说明BdEcR-B1在蜕皮激素信号传导中直接调控其配体和共激活子的表达。综上所述,本研究通过高通量测序、RT-PCR和RACE技术,分离克隆获得桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路基因cDNA全长序列,借助qPCR手段分析其在不同发育阶段、不同组织、饥饿胁迫以及激素处理条件下的表达模式,明确其调控机制和表达规律。同时,利用生测技术,研究饥饿和外源20E对桔小实蝇幼虫发育的影响。在此基础上,进一步利用RNAi技术,验证BdEcR-B1在蜕皮激素信号级联反应中的中心地位。研究结果有助于阐明蜕皮激素对昆虫发育和变态的调控机制,加深蜕皮激素合成与信号基因功能的认识,并为以上述通路基因为靶标的害虫防治方法提供理论依据和实践价值。