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感染兰花的病毒有马铃薯X病毒属(Potexvirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)等。目前兰花上至少报道了27多病毒,其中齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是分布最广,危害最严重的兰花病毒之一,ORSV常与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)复合感染兰花,给兰花造成了巨大的经济损失。除逆转录病毒外,所有正链RNA病毒的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),与病毒编码的某些蛋白以及宿主细胞因子构成复制酶系统,负责病毒基因组的复制机制。其中,RdRp为复制酶系统中的核心成分,其介导抗病性,不仅抗性程度强而且持续时间长,成为最好的抗病毒基因工程策略之一。本研究采用基因工程手段,构建原核表达载体,并制备而相应抗体,为后期研究RdRp的结构和功能打下基础。同时制备了真核表达载体,并通过农杆菌介导转化烟草,为后期兰花抗病毒试验打下基础。(1)本实验成功构建原核表达载体pET32a(+)-ORSV RdRp,测序结果说明该片段有516个氨基酸残基,编码171个氨基酸残基,从His-tag标签开始翻译约36KD重组蛋白。优化的原核表达体系条件为:37℃、0.5mmol/L IPTG、≥6h;对超声破碎诱导后的菌体离心后进行SDS-PAGE,其结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在;采用切胶制备抗原,通过免疫BABL/C小鼠获得多克隆抗体,并对其效价及特异性进行检测。所制备的多克隆抗体具有较高的效价和特异性,可应用在ORSV RdRp蛋白的免疫学检测分析上,为进一步深入研究ORSV RdRp的细胞内定位及生物学功能提供了一个有效的工具。(2)成功构建了重组植物表达载体pCAMBIA1301-RdRp,转化根癌农杆菌LBA4404后,利用注射法感染本氏烟。利用潮霉素(Hyg)初步筛选出转RdRp基因的植株。经DNA、RNA以及蛋白水平的检测,结果表明RdRp基因整合到烟草基因组中。