研究背景与目的LncRNA是长度大于200个碱基的非编码RNA,它们作用广泛,主要以顺式及反式作用调控基因表达,在多种生理和病理过程中发挥重要作用。在心血管领域,LncRNA作为重要的转录调节因子,参与调节动脉粥样硬化、心力衰竭等多种心血管疾病的发生发展。人类基因中约有100,000种LncRNA,然而绝大多数LncRNA的生物学功能尚不清楚。既往研究表明LncRNA主要调控其转录位点附近基因的表达来发挥功能。我课题组于2007年报道了一个PRKAG2综合征的家系,随后对PRKAG2综合征及PRKAG2基因进行了一系列研究。前期研究发现PRKAG2基因突变将导致AMPK活性异常,进而引起心脏代谢的紊乱。PRKAG2基因启动子区存在一个LncRNA,即PRKAG2-AS1。同时,根据选择性转录起始位点不同,PRKAG2可以形成五种不同亚型。鉴于PRKAG2基因参与调控AMPK活性,而后者活性异常将导致多种心血管疾病表型,加之LncRNA可以调控邻近基因的表达,由此我们提出科学问题,PRKAG2-AS1是否可作为调控元件参与PRKAG2基因剪接水平的基因调控,从而调节细胞生物学功能,并参与调控心肌及内皮细胞凋亡。我们推测PRKAG2-AS1可能作为脚手架来募集转录因子,在PRKAG2多种亚型选择性转录起始过程发挥重要功能,实现选择性转录起始。不同的PRKAG2亚型功能可能发挥不同生物学功能,从而导致心血管疾病。本课题选择PRKAG2-AS1作为研究对象,观察在心肌缺氧模型及内皮细胞凋亡模型中PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型表达水平改变,并进一步对PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型的生物学功能及其相互作用关系进行了探索研究。这将有助于我们深入理解PRKAG2-AS1及PRKAG2多种亚型对心血管疾病的影响,从而为精准医学治疗提供更精确的作用靶点。第一部分PRKAG2-AS1参与调控心肌细胞凋亡研究方法:1.通过NCBI网站检索,对PRKAG2基因进行生物信息学在线分析。2.选用人心肌细胞系AC16为主要研究对象,使用RNA核质分提,q RT-PCR的方法检测PRKAG2-AS1在心肌细胞中的表达模式。3.琼脂糖凝胶电泳的方法检测PRKAG2五种亚型在AC16、HUVEC、HCAEC、293T四种细胞系中的表达模式。4.PRKAG2-AS1参与调控心肌细胞凋亡的可能机制:（1）AC16置于1%O₂孵箱中培养12h,构建心肌缺氧损伤模型。使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测模型中细胞凋亡,q RT-PCR检测模型中SOD以及PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型的表达水平。（2）分别使用si RNA、反义寡核苷酸技术,敲低细胞中PRKAG2-AS1的表达,q RT-PCR验证敲减效率,并检测心肌细胞中PRKAG2b、d亚型、SOD以及心衰标志物m RNA表达水平,使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,Western blot检测AMPKγ₂蛋白表达水平。（3）特异性si RNA分别敲低细胞中PRKAG2b、d表达,q RT-PCR的方法验证敲减效率,并检测SOD及心衰标志物的表达水平,使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测心肌细胞凋亡情况。结果:1.PRKAG2基因启动子处存在一个LncRNA,即PRKAG2-AS1,根据不同的转录起始位点,PRKAG2可产生a、b、c、d、e五种不同亚型。2.PRKAG2-AS1在心肌细胞胞质及胞核中均有表达,且主要在胞核中表达。3.PRKAG2五种亚型中以PRKAG2b、PRKAG2d表达水平相对最高。4.相对于常氧对照组,缺氧12h心肌细胞Annexin V+/PI+及Annexin V+/PI-染色细胞增多（p<0.05）,SOD1、SOD3、ANP及MYH6表达水平降低（p<0.05）,PRKAG2-AS1及PRKAG2b、PRKAG2d两种亚型的表达水平均明显降低（p<0.05）。相对于NC对照组,使用特异性si RNA及反义寡核苷酸的方法能够有效降低心肌细胞中PRKAG2-AS1表达水平（p<0.05）。si RNA敲低胞质PRKAG2-AS1组较NC对照组,Annexin V+/PI-染色细胞增多（p<0.05）,下调SOD1表达水平并上调SOD2及SOD3表达水平（p<0.05）,同时能够降低AMPKγ₂蛋白表达水平,但对ANP、BNP、MYH7、MYH6以及PRKAG2b、d亚型基因表达水平无明显影响。而oligo敲低胞核PRKAG2-AS1后,相对于NC对照组,Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+染色细胞增多（p<0.05）,SOD1、SOD3表达水平降低（p<0.05）,并能够显着降低MYH6表达水平,升高BNP表达水平（p<0.05）,降低AMPKγ₂蛋白表达水平。此外,还能够降低PRKAG2d表达水平（p<0.01）,但对PRKAG2b表达水平无明显改变。通过引入PRKAG2b、d特异性si RNA,较NC对照组,能够分别有效降低心肌细胞中PRKAG2b、d亚型的表达水平（p<0.05）。敲低PRKAG2b及PRKAG2d相对于NC对照组,均可导致MYH6、MYH7表达水平降低,但对ANP、BNP及SOD的表达水平无明显改变,同时未见明显心肌细胞凋亡。结论:1.PRKAG2-AS1在心肌细胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响心肌SOD、心衰标志物的表达水平。2.胞核内的PRKAG2-AS1可能在心肌细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。3.PRKAG2存在五种亚型,其中PRKAG2b及d两种亚型表达相对较多。4.胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。5.除了PRKAG2b、d亚型,PRKAG2-AS1可能在心肌缺氧诱发的细胞凋亡中,还通过调控其它基因的表达来发挥生物学功能。第二部分PRKAG2-AS1参与调控内皮细胞凋亡研究方法:1.选用人脐静脉内皮细胞系HUVEC为主要研究对象,使用RNA核质分提进一步q RT-PCR的方法及RNA原位杂交技术检测PRKAG2-AS1在内皮细胞中的表达模式。2.使用ox-LDL处理内皮细胞24小时以构建内皮细胞凋亡模型,q RT-PCR检测内皮细胞凋亡模型中炎性因子IL-6、IL-10 m RNA表达水平3.PRKAG2-AS1的生物学功能研究:（1）使用q RT-PCR检测内皮细胞凋亡模型中PRKAG2-AS1及PRKAG2b、d亚型表达水平;（2）使用si RNA及反义寡核苷酸,敲低细胞PRKAG2-AS1的表达,并使用RNA核质分提的方法分别验证敲减效果;（3）利用CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移能力、小管形成实验检测细胞成管能力、TUNEL以及Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,以检测PRKAG2-AS1对内皮细胞功能的影响;（4）通过q RT-PCR方法检测敲低胞核内PRKAG2-AS1及PRKAG2b、d亚型表达后内皮细胞中炎性因子及凋亡相关因子的表达水平,蛋白免疫印迹法检测进一步验证敲低胞核内PRKAG2-AS1增殖及凋亡相关蛋白的表达;（5）腺病毒过表达PRKAG2-AS1后,细胞RNA核质分提及q RT-PCR法验证过表达效率,并检测细胞PRKAG2b和PRKAG2d基因的表达水平;4.PRKAG2b、d亚型的生物学功能研究:特异性si RNA分别敲低PRKAG2b、PRKAG2d,通过q RT-PCR方式验证敲减效率,并检测炎症相关因子IL-6及IL-10m RNA表达水平;5.选用CHIRP方法,进一步验证PRKAG2-AS1与b、d亚型的关系。结果:1.PRKAG2-AS1在内皮细胞胞质胞核中均有分布,且核内居多。2.相对于对照组,内皮细胞凋亡模型中IL-6及IL-10表达水平均升高（p<0.05）,PRKAG2-AS1表达水平降低（p<0.05）,PRKAG2d基因表达水平升高（p<0.05）,而PRKAG2b基因表达无明显变化。3.特异性si RNA主要降低了胞质中PRKAG2-AS1的表达水平,而oligo主要降低了其在胞核中的表达。4.CCK8法检测细胞增殖能力,结果提示相对于NC对照组,随观察时间的延长,敲低胞核内PRKAG2-AS1组细胞OD值增长明显缓慢。划痕实验通过镜下观察及Imaje J软件统计分析,发现敲低核内PRKAG2-AS1组划痕12h及24h后,划痕间距显著高于NC对照组（p<0.01）。小管形成实验,通过观察光学显微镜下发现NC对照组广泛连接成小管,而敲低细胞核内PRKAG2-AS1组细胞散在分布,未见管腔形成。进一步通过Imaje J软件分析,发现敲低核内PRKAG2-AS1组节点数、交叉点数、网眼数均显著低于NC对照组（p<0.01）。TUNEL试剂盒检测细胞凋亡,结果表明相对于NC对照组,敲低细胞核内PRKAG2-AS1组细胞凋亡明显增加,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞学检测细胞凋亡,结果显示oligo敲低PRKAG2-AS1组较NC对照组,Annexin V+/PI-、Annexin V+/PI+染色细胞明显增多,（p<0.01）。这些结果提示敲低核内PRKAG2-AS1显著抑制内皮细胞的增殖、迁移及小管形成能力,并促进内皮细胞凋亡,尤其是早期及晚期细胞凋亡。5.敲低胞质中PRKAG2-AS1相对于对照组,细胞中IL-6表达水平升高,IL-10表达水平降低（p<0.05）,而CRP、MCP1表达水平无明显变化。凋亡相关因子BCL2、Caspase3 m RNA表达水平无明显改变;而敲低胞核中的PRKAG2-AS1相对于对照组,IL-6、IL-10、CRP及MCP1表达水平均显著升高（p<0.05）相对于对照组,凋亡相关因子BCL2 m RNA表达水平升高（p<0.05）,同时,BAL2及Cleaved-Caspase3蛋白表达水平均升高,PCNA的蛋白表达水平降低。此外,敲低胞质及细胞核内PRKAG2-AS1均可导致PRKAG2d亚型表达降低（p<0.05）,而PRKAG2b亚型表达改变无统计学意义。6.相对于GFP对照组,转染特异性腺病毒后,细胞内PRKAG2-AS1表达明显升高（p<0.05）,且主要使得胞核中PRKAG2-AS1表达水平升高。相对于对照组,腺病毒过表达PRKAG2-AS1后PRKAG2d表达水平升高。7.敲低PRKAG2d后,相对于NC组,IL-6表达水平降低,而IL-10表达上调（p<0.05）。而敲低PRKAG2b相对于NC组,IL-6及IL-10基因表达水平无明显改变。8.CHIRP结果提示,加入了特异性生物素标记的probe组PRKAG2d基因表达量明显多于较未加入探针的ctl组,这一趋势与PRKAG2-AS1的表达模式相同。而PRKAG2-b表达模式与之相反。提示PRKAG2-AS1与PRKAG2d相互作用。结论:1.PRKAG2-AS1在内皮细胞胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响内皮细胞中炎性因子的表达。2.胞核内的PRKAG2-AS1能够促进内皮细胞增殖、迁移及成管能力,抑制内皮细胞凋亡。3.PRKAG2-AS1可能在内皮细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。4.胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。全文总结1、PRKAG2-AS1在心肌及内皮细胞胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响心肌SOD、心衰标志物的表达以及内皮细胞中炎性因子的表达。2、胞核内的PRKAG2-AS1可能在缺氧诱发的心肌细胞凋亡及ox-LDL诱发的内皮细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。3、PRKAG2存在5种亚型,其中PRKAG2b及d两种亚型表达相对较多。4、胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。5、除了PRKAG2 d亚型,PRKAG2-AS1可能在心肌细胞凋亡及内皮细胞凋亡中,可能还通过调控其它基因的表达来发挥生物学功能。