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严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)是人类在21世纪初遭遇的烈性传染病之一,我国为该病的重要疫区。其病原体为SARS冠状病毒(SARS Coronavirus,SARS-CoV)。目前对其尚无特效的治疗方法,因而探索有效的抗SARS病毒新途径势在必行。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是基于RNA水平的抗病毒策略,凭借自身的特异、高效、快速等优势,它已成为抗病毒领域的研究热点之一。RNAi的发现和应用为治疗SARS病毒感染提供了新思路。 本研究拟开展以下两方面内容,观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。探索抗SARS病毒感染的新途径。 一.siRNA的设计合成及其对SARS病毒部分复制酶基因的抑制作用 由于复制酶基因的表达是SARS病毒启动转录的前提,而刺突蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥着重要作用,因此选择SARS病毒复制酶基因(rep)和刺突蛋白基因(s)的保守序列作为靶基因,设计并合成9种siRNA(pS01～09),其中pS01～07针对rep基因,pS08～09针对s基因。由于体外合成的siRNA不易操作且基因干涉作用持续时间短,故采用构建siRNA表达载体的方法在体内合成siRNA。 同时,构建融合表达绿色荧光蛋白(GFP)基因和部分rep基因的重组载体,将已构建好的识别rep基因的siRNA表达载体与重组载体共转染293T细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析融合基因的表达情况。结果表明,针对SARS病毒rep基因第3504nt-3522nt的siRNA可使rep基因的表达量下降33%,说明siRNA可特异而有效地抑制基因的表达。 二.siRNA在Vero细胞中的抗SARS病毒作用 为进一步研究siRNA对SARS病毒复制的抑制作用,将构建的siRNA表达载体分别转染Vero细胞,获得稳定转录siRNA的克隆细胞株V/pS01、03、05～09及对照细胞株V/pSN,然后以BJ01株病毒悬液感染克隆细胞,通过病毒滴度测定和间接免疫荧光实验观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。结果表明,针对rep基因和s基因的siRNA(pS05和pS08)呈现出了良好的抗病毒效果,在接种SARS病毒后均未检测到病毒的特异性抗原,且病毒滴度下降10~3～10~4倍。另外,通过实时定量RT-PCR检测病毒感染的细胞上清中rep基因的含量,结果显示,细胞株V/pS05中rep