前言　　 随着现代饮食习惯和生活方式的改变,在世界范围内糖尿病的发病率逐年增加。在西方国家,糖尿病肾病是引起终末期肾病(ESRD)最常见的病因,在发展中国家,其发病率也逐年增加。蛋白尿和肾小球硬化是糖尿病肾病最主要的特征。近年来应用ARB类药物的强化治疗通过减少蛋白尿的排出,能改善糖尿病肾病患者的预后,但是在一些情况下,ARB也不能起作用。近年来人们越来越意识到脂毒性在糖尿病肾病进展过程中的作用,游离脂肪酸结合的白蛋白被肾小球滤过膜滤过,从近曲小管重吸收,能引起严重的小管间质损伤。肾小管间质损伤与慢性肾脏病预后的关系更加密切,因此有必要研发新的治疗策略,防止和延缓小管间质损伤的进展,改善糖尿病肾病的预后。　　 过氧化物增殖体激活受体(Peroxisome proliferator activated receptors(PPARs))属于配体激活的转录因子核受体超家族的一员。目前发现该家族有3种异构体:PPARα,δ和γ。作为转录因子的PPARs通过调节特定的目的基因的表达,影响脂代谢,糖代谢稳态,细胞分化,免疫反应,炎症和肿瘤等重要的代谢过程。PPARs能被大量的内源性和越来越多的外源合成的配体所激活。PPARα受体激动剂(贝特类)和PPARγ受体激动剂(噻唑烷二酮类)作为降脂药物和胰岛素增敏剂已经在临床上广泛应用,而且被证明具有肾脏保护作用;而PPARδ受体激动剂出现的较晚,还处于临床试验阶段,其是否具有肾脏保护作用还没有定论。目前一些研究表明PPARδ受体参与炎症的过程,在心脏,脂肪组织,内皮细胞,巨噬细胞等组织和细胞中PPARδ受体激动剂有抗炎作用,但是PPARδ受体在肾脏组织和细胞的作用还鲜有报道。　　 目的:　　 基于这些发现,我们假设PPARδ受体激动剂在近曲小管上皮细胞能发挥抗炎作用,是一种潜在的治疗糖尿病肾病的新选择。为了证明这一假设,我们利用GW501516这一高选择性的PPARδ受体激动剂进行以下实验:利用游离脂肪酸结合的白蛋白诱导的蛋白负荷性肾病小鼠模型这一小管间质损伤的模型,给予PPARδ受体激动剂GW501516,观察PPARδ受体激动剂是否能发挥抗炎作用,减轻小管间质的损害;利用培养的小鼠近曲小管上皮细胞,观察GW501516是否能减轻饱和脂肪酸,TNF-α和白蛋白诱导的炎症反应并探讨其分子机制。　　 方法:　　 建立脂肪酸结合白蛋白诱导的蛋白负荷性肾病小鼠模型。预先用含有PPARδ受体激动剂501516的治疗食物和对照食物喂养小鼠,实验结束时肾脏行HE染色,F4/80免疫组化染色,观察治疗组和对照组肾小管间质损伤以及肾间质中巨噬细胞浸润的变化。并用实时定量PCR方法检测肾组织中巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),F4/80 mRNA水平的变化,　　 培养小鼠近曲小管上皮细胞系,研究PPARδ受体激动剂GW501516是否能抑制白蛋白,饱和脂肪酸和TNF-α诱导的MCP-1mRNA水平的变化。利用干扰RNA(siRNA)介导的PPARδ基因敲除研究GW501516的抗炎作用是否通过PPARδ受体实现,并研究核因子-Kappa b(NF-Kb)的信号转导途径在GW501516抗炎过程中的作用。　　 结果:　　 (1)与对照组相比,脂肪酸结合的牛血清白蛋白腹腔注射4天组小鼠体重减轻(20.52±1.53g vs26.26±2.62 g,p＜0.05)肾重/体重的比率增加(0.84±0.1％vs0.64±0.03 p＜0.05)。与GW501516对照组相比,蛋白负荷+GW501516治疗组体重也减轻(20.2±1.53 g vs24.25±1.11g p＜0.05),肾重/体重的比率增加(0.86±0.14％VS0.56±0.02％,p＜0.05)。但蛋白负荷组与蛋白负荷+GW501516治疗组之间无明显差异(20.52±1.53 VS20.2±1.53,p＞0.05)。而各组血清胱抑素水平在实验前和实验后无明显变化(678.64±27.95 ng/ml VS579.68±51.55 ng/ml VS618±84.27 ng/mlVS573.12±60.75 ng/ml),各组间的差异不显著(p＞0.05)。　　 (2)HE染色显示:腹腔注射游离脂肪酸结合的白蛋白能引起严重的近曲小管损伤,病理改变特征为弥漫性的近曲小管上皮细胞空泡变性,肾小管细胞萎缩和管腔扩张,管型形成。预先喂食含有GW501516食物的小鼠其小管损伤明显减轻。而对照组和单纯GWS01516治疗组的近曲小管上皮细胞无明显的变化。模型组的肾小管损伤评分明显增加,而GW501516治疗组的肾小管损伤评分明显改善(2.925±0.993 vs1.467±0.776),有统计学意义(p＜0.05)。F4/80免疫组化染色显示模型组在肾小管周围肾间质区F4/80阳性的巨噬细胞明显增加,而GW501516治疗能明显地减轻巨噬细胞的浸润。　　 (3)与对照组相比,蛋白负荷组肾脏MCP-1,TNF-α和F4/80mRNA的表达水平明显增加,GW501516治疗使三者的表达明显降低,且与模型组比较有显著差异(p＜0.05)。　　 (4)150uM的棕榈酸,10nMTNF-α和30％白蛋白刺激12小时能诱导小鼠近曲小管上皮细胞MCP-1在mRNA水平上的表达增加,而GW501516以剂量依赖(1um,2.5um,5um)的方式抑制棕榈酸和TNF-α和诱导的MCP-1表达的增加。在5 um浓度下,这种抑制作用有统计学意义(p＜0.05)。但是GW501516在任何浓度下均不能抑制白蛋白诱导的MCP-1水平的增加。　　 (5)PPARδsiRNA能在蛋白水平和基因水平阻断PPARδ受体的表达,而且在阻断细胞中GW501516诱导PPARδ受体靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4),脂肪细胞分化相关蛋白(ADRP)的表达相应被阻断。但是在阻断细胞中GW501516仍然能够发挥抗炎作用,抑制棕榈酸和TNF-α诱导的MCP-1在mRNA水平的表达。　　 (6)培养的近曲小管上皮细胞在棕榈酸刺激后1小时,抑制激酶B(IkB)的磷酸化增加,p65的核转移也增加。其上游的调节因子丝裂原活化蛋白激酶MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)及转化生长因子β-激活激酶1(TAK1)的磷酸化在棕榈酸刺激1小时后也增加。而GW501516预处理能抑制TAK1,IkB的磷酸化和p65的核转移。而对MAPKs(JNK,P38,ERK1/2)的磷酸化不发生影响。　　 (7)在TNF-α刺激的近曲小管上皮细胞,我们也得到类似的结果。培养的近曲小管上皮细胞在TNF-α刺激后5分钟后,IkB的磷酸化增加,10分钟后p65的核转移也增加。其上游的调节因子TAK1的磷酸化在TNF-α刺激5分钟后也增加。而GW501516预处理抑制IkB的磷酸化和p65的核转移,以及TAK1的磷酸化。　　 结论:　　 (1)在游离脂肪酸结合的白蛋白负荷性肾病小鼠模型中,脂蛋白重吸收导致近曲小管损伤和巨噬细胞在间质的浸润,并引起炎症性细胞因子MCP-1,TNF-αmRNA水平的升高。PPARδ受体激动剂GW501516能减轻游离脂肪酸结合的白蛋白负荷性肾病大鼠肾小管间质的损伤和炎症反应,具有肾脏肾脏保护作用。　　 (2)在培养的小鼠近曲小管上皮细胞中,PPARδ受体激动剂GW501516能抑制棕榈酸和TNF-α诱导MCP-1mRNA水平的增加,但是GW501516不能抑制白蛋白诱导的小鼠近曲小管上皮细胞MCP-1mRNA水平的增加。GW501516在近曲小管上皮细胞能发挥抗炎作用。　　 (3)PPARδ受体激动剂GW501516的抗炎活性可能与PPARδ受体本身无关。GW501516能通过抑制TAK1-NF-KB信号途径而发挥抗炎作用。而MAPKs不参与GW501516的抗炎机制。