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蛋白质是重要的生物活性分子,不仅参与着几乎所有正常的生理过程,而且其异常表达还与癌症、爱滋病、糖尿病等多种重大疾病相关。因此,针对重大疾病相关的蛋白质标志物进行高选择性、高灵敏检测的研究对重大疾病早期诊断具有十分重要的意义。目前,临床上常用的蛋白质标志物检测方法是基于抗原抗体特异性结合的免疫分析法,但传统免疫分析法如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等均存在灵敏度低、操作繁琐等缺点,在应用于重大疾病早期诊断时无法满足生物样品中超低含量蛋白质标志物检测的需求。近年来,纳米技术和核酸信号放大技术由于其强大的信号增敏功能已成为提高分析灵敏度的两种重要方法,并在高灵敏生物检测中发挥着重要作用。特别是在蛋白质分析领域,纳米技术和核酸信号放大技术的引入可提高传统蛋白质分析方法的检测灵敏度,实现低丰度蛋白质标志物的测定。尽管如此,大部分基于纳米技术和核酸信号放大技术仍需要分离、洗涤等复杂的操作步骤或昂贵的特殊仪器。另一方面,随着越来越多与疾病相关的蛋白质标志物不断发现和蛋白质标志物临床应用的逐步深入,对于蛋白质标志物的分析检测方法也提出新的要求。因此,研究和发展普遍适用性好、操作简便、快速、灵敏度更高的蛋白质分析新方法与新技术仍然仍是当前生物分析领域的研究热点。本文以与癌症相关的蛋白质标志物为靶标,利用核酸适体和抗体的特异性分子识别作用,结合邻近杂交分析技术和核酸信号放大技术的优势,发展高灵敏、高选择性的荧光生物传感新方法,并成功用于复杂生物样品中蛋白质标志物含量的测定。具体研究内容如下:1.利用目标物诱导DNA邻近杂交的原理,结合脱氧核酶（DNAzyme）信号放大技术,我们构建了一种新型高灵敏荧光适体传感器用于癌胚抗原（CEA）检测。该传感体系包括触发DNA、辅助DNA和纳米金标记的发夹式DNAzyme荧光底物。在没有目标物CEA存在时,触发DNA和辅助DNA中的适体序列不能与CEA结合,不能组装形成完整的DNAzyme,亦不能在Zn2+作用下催化切割底物,此时由于纳米金的荧光淬灭作用体系的荧光很弱。当加入目标物CEA后,触发DNA和辅助DNA中的适体序列同时与CEA结合,并通过临近杂交组装形成完整的DNAzyme,即激活DNAzyme。激活的DNAzyme能够在Zn2+作用下催化循环切割纳米金表面的底物,使许多荧光基团标记的底物片段脱离纳米金表面,荧光显著增强。在优化的实验条件下,CEA的浓度在6 pg/mL～60 ng/mL范围内与荧光强度成良好的线性关系,检测限为3.4 pg/mL。该方法成功用于人血清中CEA含量的测定,其结果与传统酶联免疫分析法的测定结果一致。2.基于目标物介导DNA邻近杂交引发等温指数扩增反应的原理,我们发展了一种超灵敏荧光适体传感新方法用于血管内皮生长因子（VEGF165）的快速测定。在该方法中,我们将VEGF165的核酸适体序列分成两片段分别嵌入触发DNA和辅助DNA中,且辅助DNA中含有一分子信标片段和限制性内切酶Nb.BbvCI的识别位点。触发DNA和辅助DNA设计为只含6个碱基的互补序列。在没有VEGF165存在时,触发DNA和辅助DNA由于它们的互补序列较短不能稳定杂交,此时不能引发等温指数扩增反应,体系的荧光较弱。当向体系加入VEGF165时,触发DNA和辅助DNA中的核酸适体片段同时与VEGF165结合,使触发DNA和辅助DNA相互靠近并发生杂交。在DNA聚合酶的作用下,触发DNA和辅助DNA可分别作为引物和模板引发聚合反应,将分子信标片段的茎环结构破坏并生成具有完整Nb.BbvCI识别位点的双链DNA,体系的荧光开始增强。聚合反应形成的双链DNA被Nb.BbvCI切割并形成新的聚合位点,引发聚合反应,生成新的具有完整Nb.BbvCI识别位点的双链DNA,同时置换出被切割的单链DNA。而生成的新双链DNA又可引发新一轮切割反应,从而形成聚合-切割-置换循环反应,产生许多单链DNA。这些单链DNA能与辅助DNA中的分子信标序列杂交,并打开茎环结构。打开的分子信标序列能与引物DNA杂交并引发聚合反应,生成新的具有完整Nb.BbvCI识别位点的双链DNA,同时使单链DNA置换下来。而置换出来的单链DNA又能与分子信标序列杂交,引发新一轮聚合反应,形成单链DNA循环,并生成许多双链DNA。而生成的双链DNA又能重新促发上述聚合-切割-置换循环反应,实现DNA产生和循环,最后导致大量的分子信标片段的茎环结构破坏,使荧光显著增强,实现信号放大检测VEGF165。在优化的实验条件下,VEGF165的检测限达到了 1.25 fmol/L。此外,该方法还具有很高的特异性,并成功应用于人血清中VEGF165含量的测定。3.利用目标物介导DNA邻近杂交引发限制性内切酶信号放大的原理,结合纳米金的高荧光淬灭特性,我们构建了一种新型多元荧光免疫传感器用于多种蛋白质的同时检测。该传感体系包括三对抗体标记DNA、纳米金修饰的三色分子信标和BfuCI限制性内切酶。每对抗体标记DNA均含有6个碱基的互补序列和两BfuCI识别位点。在没有目标蛋白存在时,三对抗体标记DNA由于其互补序列很短不能相互杂交,不能引发限制性内切酶信号放大反应,此时分子信标中荧光染料的荧光被纳米金淬灭。当向体系加入目标蛋白质时,每对抗体标记DNA中的抗体同时与其对应的目标蛋白质结合,使这两条DNA链相互靠近并发生杂交,形成临近复合物。临近复合物能与纳米金表面相应的分子信标序列杂交,形成具有完整BfuCI识别位点的双链DNA。在限制性内切酶BfuCI的作用下,纳米金表面的分子信标被切断,使相应的荧光染料掉下来,同时释放出临近复合物,荧光恢复。释放出来的临近复合物又能与纳米金表面另一相应的分子信标序列杂交,引发新一轮切割反应,形成临近复合物循环,实现荧光信号放大,从而达到对目标物蛋白质放大检测的目的。我们以肿瘤标志物前列腺特异抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）为模型分析物对该传感方法的可行性进行了验证,在优化的实验条件下PSA、CEA和AFP的检测限分别为1.42 pg/mL、0.56 pg/mL和2.2 pg/mL。此外,该方法还表现出良好的特异性,不会发生交叉反应。该方法成功应用于人血清中PSA、CEA和AFP含量的同时测定,其结果与传统酶联免疫分析法的测定结果一致。