目的:探求胱硫醚-β-合成酶基因CBS中具有启动子活性的区域,确定其最小的启动子区域,寻找对CBS基因转录起关键作用的顺式作用元件所在区域并探索该区域序列中影响启动子活性的核心碱基。方法:设计引物,以HEK293细胞全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增目的基因CBS上游不同区域片段,插入p GL3-basic载体中,即构建CBS基因上游调控序列荧光素酶报告基因载体。常规培养HEK293细胞,将所构建的不同荧光素酶报告基因载体分别与内参海肾荧光素酶报告基因载体一同转入HEK293细胞内,待继续培养24小时后检测报告基因的转录活性,根据荧光素酶活性检测结果确定CBS基因中具有启动子活性的区域,并进一步比较、分析得出影响报告基因活性的功能区。针对这些区域利用基因定点突变技术进行碱基的连续突变,构建不同的突变CBS基因荧光素酶报告基因载体,分析这些碱基突变对报告基因活性的影响从而确定影响启动子活性的核心碱基。结果:成功构建出包含不同区域的CBS基因启动子-荧光素酶报告基因载体,最长插入序列片段为1825bp,包含CBS基因翻译起始位点上游-4765bp至-2941bp的序列。-4048/-3439在所检测的片段中活性最强,5’端删切发现-4048至-4039之间可能有增强基因转录的功能区域。3’端删切发现-3439至-3520之间序列可能含有能增强转录的功能区域,-3569至-3604区间序列可能含有能抑制转录的功能区。结论:通过实验找到了CBS基因具有最强启动子活性的基因组序列。确定了功能区-4048/-4039、-3439/-3520及-3569/-3604,与以上功能区相互作用的转录因子有待进一步深入的实验验证。目的:研究酒精对淀粉样前体蛋白基因APP和β位淀粉样前体蛋白裂解酶1基因BACE1表达水平的影响。方法:常规培养2EB2、SH-SY5Y、SH105细胞系,利用质粒体转染试剂Lipofactamine2000将分别含有人APP和BACE1基因启动子区域序列的报告基因载体与内参质粒P3PRluc共同转入SH-SY5Y细胞中,培养12小时后使用不同浓度酒精(0,0.4,1.6,3.2mg/ml)干预24小时后收细胞,用双荧光素酶检测试剂测定荧光素酶活性。通过比较不同梯度酒精干预后Fluc/Rluc的值来确定酒精对启动子活性的影响。不同浓度梯度酒精干预48小时后SH-SY5Y、SH105细胞分别用于提RNA和蛋白质,通过RT-PCR和蛋白免疫印迹实验从转录水平和蛋白水平证实酒精对APP和BACE1表达的影响。此外,酒精(3.2mg/ml)干预48小时后的2EB2细胞与未经酒精处理组细胞均给予100μg/ml环己酰亚胺干预不同的时间(0,15,30,60min)后收细胞,用蛋白免疫印迹实验检测APP和BACE1的蛋白变化情况,比较酒精干预对其降解的影响。结果:与对照组相比,酒精干预组APP和BACE1基因启动子活性显著增高;SH-SY5Y细胞内源性APP和BACE1基因的m RNA水平在一定浓度酒精作用下上调;并且,在SH105细胞中,检测到较对照组重庆医科大学硕士研究生学位论文升高的APP和BACE1蛋白表达水平;而APP和BACE1蛋白的降解途径并未受到影响。结论:我们发现在细胞实验中,酒精通过激活细胞中APP和BACE1基因启动子活性,增强其转录和上调蛋白质的表达。