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脑缺血/再灌注损伤是一个非常复杂的,涉及多种细胞、分子网络的病理生理过程;常规的神经保护药物通常只针对该损伤网络中的某一个结点,很难全面抑制~瀑布式级联反应导致的脑组织损伤。针对这些问题,在结合前期工作的基础上,分别采用低温冷敷和抗氧化药物治疗的手段对脑缺再灌注损伤的机制及其保护治疗手段的探索。本项目选择小鼠大脑中动脉栓塞/再通模型,以不同温度、相同持续时间的组合观察脑梗死区局部低温、梗死体积和神经功能变化,寻找最佳低温治疗条件;观察该条件下低温对神经血管单元形态结构及其微血管通透性屏障的保护效果;检测主要结构蛋白(ZO-1,occludin,claudin5)和基质蛋白酶(MMP-2,MMP-9)的表达变化及其与冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)的关系,探讨低温保护微血管通透性屏障的可能机制。研究结果将为脑局部低温联合闭塞血管再通治疗急性脑梗死提供重要的理论和实验依据。脑缺血缺氧后由于活性氧自由基的产生,造成星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,引起淋巴细胞的浸润,炎症因子的产生,炎症反应又引起二次损伤。因此,有效的减轻活性氧自由基的产生,减轻胶质细胞的活化又是临床需解决的问题。本研究通过低温对血脑屏障结构的保护和丹酚酸B(Sal B)抗氧化作用研究脑缺血再灌注的保护机制,为其临床应用奠定基础。研究结果如下:(一)探讨丹酚酸B(Sal B)的抗氧化作用及其在脑缺血再灌注损伤过程中保护机制。通过TTC染色和MRI扫描分析,Sal B能够显著降低梗死体积,同时改善神经行为学功能,显著降低活性氧自由基的产生(p<0.05,n=10)。Western blotting和qRT-PCR分析表明,Sal B能够抑制星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(Iba 1)的活化,同时降低炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-a)和caspase3的活化(p<0.05,n=10)。这些数据表明,Sal B能够保护脑缺血再灌注损伤,可以作为临床上治疗脑缺血的药物使用。(二)采用脑局部冰帽,对梗死侧大脑进行低温冷敷治疗,分别设置不同的治疗温度(4 ℃、10 ℃和15 ℃)和不同治疗时间点(缺血后治疗、缺血再灌注后治疗、再灌注后1 h治疗和再灌注后2 h治疗),实验研究证实缺血后4℃治疗、缺血再灌注后4℃治疗和缺血后10℃治疗对脑缺血模型有确切的神经保护作用。claudin-5,occludin和ZO-1的mRNA与蛋白表达水平相对于模型(I/R)组有显著性升高,结果有显著性差异(p<0.05)。研究发现,CIRBP在缺血后大脑的皮质和海马中发现增加,并且在暴露于低温环境下的缺血性大脑中量增加更加明显。在4℃缺血治疗组、4℃缺血再灌注治疗组和缺血后10℃治疗组mRNA与蛋白表达水平相对于模型(I/R)组有显著性升高,结果有显著性差异(p<0.01)说明CIRBP在低温对缺血性大脑起到保护作用。为研究CIRBP在低温时对缺血大脑的保护作用,我们利用CRISPR/Cas9敲除小鼠低温诱导蛋白(CIRBP)基因,针对CIRBP基因编码序列设计向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将此sgRNA与Cas9蛋白混合,注射C57BL/6小鼠的受精卵,实现靶基因敲除。通过T7E1酶切实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变位点。获得了 8个CIRBP基因突变的首建鼠,8只小鼠发生不同程度的碱基缺失。这8只CIRBP基因敲除小鼠的突变情况。分别有3 bp和1 bp的碱基插入,另有6 bp、8 bp、9 bp、10 bp和14 bp的碱基缺失类型。利用获得的杂合CIRBP+/-小鼠交配获得CIRBP-/-小鼠。根据临床脑缺血的发病特点及治疗手段,我们选择脑缺血再灌注后4℃治疗。分别对野生型(WT)小鼠及CIRBP-/-小鼠建立缺血再灌注(I/R)模型和再灌注后4℃冷敷治疗。发现CIRBP-/-小鼠再灌注后进行低温4℃保护,脑梗死体积并没有减少(p>0.05)。CIRBP的敲除活化了基质金属蛋白酶,导致构成微血管屏障相关的结构蛋白和微血管基底膜的降解,造成了血脑屏障的破坏。对脑微血管内皮细胞建立缺氧模型,缺氧2 h后,细胞出现凋亡。通过Western blotting分析p-AKT的活化程度,当缺糖缺氧后复氧给与正常的培养基培养细胞后,能够明显的抑制AKT的磷酸化水平,但是在OGD/R后给与低温(4℃)干预能够减轻缺糖缺氧引起的损伤,增强AKT蛋白的磷酸化水平,CIRBP的表达引起磷酸化水平的AKT表达升高,CIRBP能够通过特殊方式作用于PI3K/AKT信号通路。脑微血管内皮细胞的CIRBP蛋白通过PI3K/AKT信号通路的激活而起到保护血脑屏障的作用。