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研究背景:随着全球癌症患者数量的增加,我国的癌症负担也不断地增加。每年我国新增癌症患者300余万,有200余万患者死于癌症。在我国女性中,乳腺癌是最常见的肿瘤之一,也是女性一个重要的公共卫生问题。我国新增乳腺癌的发生率占全世界12.2%,其死亡率为9.6%。最近几年,乳腺癌的诊断和治疗方法虽然不断得到了提高,但部分患者的预后和疗效仍不理想,所以挖掘乳腺癌发生发展的潜在机理和诊断、预后新标志物对改善乳腺癌患者生存现状至关重要。本课题组前期利用全基因组表达谱筛选结合免疫组织化学(IHC)分析,均发现TC2N蛋白高表达于乳腺癌组织,推测TC2N可能参与了乳腺癌的发生发展,但是该基因在乳腺癌中的作用还不清楚。因此,本课题拟通过对TC2N基因在乳腺癌中的临床特征进行分析,评价其临床意义;同时,分析TC2N基因在乳腺癌发生中的作用和分子机制,为乳腺癌发生机制的认识和临床诊断、治疗靶标的筛选等提供新资料。研究内容:1.系统性分析TC2N在乳腺癌中的表达情况及其临床意义通过Oncomine数据库分析TC2N mRNA在乳腺癌组织和正常组织中的表达情况。用免疫组织化学染色(IHC)对乳腺癌组织和配对癌旁乳腺组织中TC2N蛋白表达情况进行验证。2.初步评价TC2N在乳腺癌细胞中的生物学功能在体外,通过MTS法、克隆形成实验分析了稳定差异表达TC2N基因的乳腺癌细胞的增殖和克隆形成情况。在体内,通过裸鼠成瘤实验分析了稳定差异表达TC2N基因在裸鼠体内对肿瘤生长的影响情况。3.分析TC2N在乳腺癌细胞中发挥作用的分子机制首先对参与乳腺癌细胞增殖调控的TC2N下游信号通路进行生物信息学分析,并利用蛋白免疫印迹实验(WB)进行验证。通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和WB实验阐明了TC2N参与调控PI3K/AKT信号通路的具体分子机制。研究结果:1.TC2N表达与乳腺癌患者的临床分期和预后相关(1)通过Oncomine数据库分析乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达情况,发现TC2N m RNA在乳腺癌组织中表达明显高于正常乳腺组织。对含有75例乳腺癌组织和配对的75例乳腺癌旁组织的组织芯片(TAM)进行TC2N蛋白的表达分析,结果也表明TC2N蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织。(2)TC2N蛋白表达与患者的临床分期(P<0.001)、肿瘤大小(P=0.021)、淋巴结转移(P<0.001)、HER-2受体的表达(P=0.039)高度相关。(3)Kaplan-Meier单因素分析和多变量COX比例风险回归分析表明,TC2N过表达乳腺癌患者的预后良好,并且TC2N是乳腺癌患者生存预后的独立因素。2.TC2N在体内/体外抑制乳腺癌细胞的增殖(1)通过TCGA数据库和GO分析进行基因富集发现,TC2N基因可能参与了乳腺癌细胞增殖和细胞存活。在体外通过MTS法和克隆形成实验对稳定差异表达TC2N基因的乳腺癌细胞的增殖评价表明,TC2N过表达显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,而TC2N低表达后乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力得到恢复,表明TC2N是一个候选的抑癌基因。(2)通过裸鼠移植瘤模型分析,发现TC2N基因过表达可抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长,提示TC2N基因在体内可以抑制乳腺癌细胞的增殖。3.TC2N通过抑制PI3K/AKT通路调控乳腺癌细胞增殖(1)对TC2N过表达基因的生物信息学分析,发现TC2N基因可能通过调控PI3K/AKT信号通路来实现抑制乳腺癌细胞增殖。在TC2N基因过表达乳腺癌细胞中,TC2N基因表达显著抑制了p55γ和AKT的磷酸化水平,同时抑制了AKT下游活化分子的激活。(2)通过蛋白组学和生物信息学分析,发现ALK、EBP1可能参与TC2N调控乳腺癌细胞AKT磷酸化水平。通过WB实验发现,干扰ALK表达可使TC2N低表达乳腺癌细胞的p55磷酸化水平显著降低,而AKT磷酸化水平部分降低;利用Co-IP实验发现,TC2N一方面可以通过与p55竞争结合ALK来抑制p55磷酸化,进一步抑制AKT磷酸化;另一方面,TC2N可与EBP1竞争结合AKT直接抑制AKT磷酸化。(3)PI3K抑制剂可以使TC2N低表达乳腺癌细胞AKT磷酸化水平部分降低,利用MTS法和克隆形成实验进行验证发现PI3K抑制剂可以使TC2N低表达乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力部分降低,提示TC2N基因抑制AKT磷酸化并非全部通过PI3K依赖的信号通路。(4)阻断PI3K/AKT通路后,TC2N低表达乳腺癌细胞的AKT磷酸化水平显著降低,同时在MTS法和克隆形成实验中发现阻断PI3K/AKT通路后TC2N低表达乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力均受到显著抑制,进一步证实PI3K/AKT信号通路是TC2N调控乳腺癌细胞增殖中的关键中介。结论:首次证明了TC2N在乳腺癌发生发展中起抑癌作用,其表达通过抑制p55γ和AKT磷酸化阻断PI3K/AKT信号通路,从而抑制乳腺癌细胞的增殖生长。TC2N是乳腺癌患者独立预后因素,是一个候选的生物标志物。