目的：环境毒理学重视与临床医学和基础医学的结合，其研究重心逐渐由单纯的剂量-效应关系向分子机制研究转移。从临床医学中发现问题，运用流行病学方法分析问题，然后利用生物医学研究技术解决问题，形成了环境毒理学系统的研究模式。白血病是危害人类健康的重大疾病，其发生与环境因素关联性很强，但是环境毒理学与白血病发生方面的研究，还有待于加强。为开展环境污染物与白血病发病机制的相关研究，必须建立环境毒理学在白血病发生研究中的方法学，因此我们选择急性早幼粒细胞临床出血并发症的分子机制研究，做为环境毒理学介入白血病发生研究的切入点。方法：纤溶亢进引发出凝血障碍是导致急性早幼粒细胞白血病（acutepromyleocytic leukemia， APL）患者早期死亡的主要原因之一，膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是调控纤维蛋白溶解系统的重要因子。基于本实验室早期对急性早幼粒细胞白血病特征性PML/RARɑ融合基因可上调AnnexinⅡ蛋白表达的初步结果，本研究继续以分子生物学和细胞生物学技术为手段，研究在急性早幼粒细胞白血病中，AnnexinⅡ异常高表达的功能及其分子机制，建立适合本环境毒理学实验室的实验研究技术。本实验分为两方面内容：AnnexinⅡ病理生理效应的研究和AnnexinⅡ高表达的分子机制研究。病理生理效应的研究集中于纤维蛋白溶解亢进和白血病细胞迁移能力方面：通过ZnSO₄体外诱导U937-PR9细胞，表达PML/RARɑ融合蛋白，上调AnnexinⅡ的表达；将AnnexinⅡ cDNA真核电转染到U937细胞中，建立过表达AnnexinⅡ的U937稳定细胞株。研究AnnexinⅡ高表达情况下，其纤维蛋白溶解酶生成和细胞迁移能力的变化。APL中AnnexinⅡ高表达的分子机制研究：1)将AnnexinⅡ启动子5’侧翼序列逐一截短，分别构建入环形质粒pGL3-Basic Vector，插入的片段位于双荧光素酶报告基因的上游，通过酶切和测序确定构建产物的正确性。2)用脂质体瞬时转染法将带有AnnexinⅡ启动子截短片段的双荧光素酶报告基因质粒、PML/RARα融合蛋白真核表达质粒、内参SV40质粒，共转染入COS-7细胞，分析PML/RARα融合基因调控AnnexinⅡ启动子的转录活性，确定PML/RARα转录激活AnnexinⅡ启动子的碱基范围，为深入分析其调控模式打下基础。结果：1.U937-PR9经100μmol ZnSO₄诱导24h可表达PML/RARα融合蛋白，进而纤溶酶原裂解能力增强，细胞降解基底膜的能力也随之增强。2.真核表达载体重组质粒和双荧光素酶报告基因重组质粒的构建。双酶切及测序结果显示，成功构建pcDNA3.1-AnnexinⅡ和含有不同长度启动子的重组质粒pGL3-AnnexinⅡpromoters （-158bp⁺120bp、-124bp⁺120bp、-62bp⁺120bp、-34bp⁺120bp、-15bp⁺120bp、+3bp⁺120bp）。3. RT-PCR和Western Blot结果显示，转染pcDNA3.1-AnnexinⅡ的U937经G418筛选，AnnexinⅡ的表达量增高，证实已获得可以稳定过表达AnnexinⅡ的U937细胞。4.蛋白功能实验。纤维蛋白溶解酶生成实验结果说明：AnnexinⅡ可以通过与组织型纤溶酶原激活剂作用，促进纤维蛋白溶解酶原裂解，生成纤维蛋白溶解酶，加入AnnexinⅡ的抗体可明显减少纤溶酶的生成。证明AnnexinⅡ可能是造成急性早幼粒细胞白血病纤溶亢进的原因。细胞迁移实验表明：过表达AnnexinⅡ的U937细胞的细胞迁移率高于正常U937，在加入抗AnnexinⅡ的抗体后，迁移能力明显下降。证明AnnexinⅡ参与了白血病细胞的浸润和转移。5.荧光素酶报告基因分析发现，PML/RARα融合基因可以显著上调AnnexinⅡ启动子，尤其自转录起始点第124位作用更为明显，可初步推断PML/RARα融合基因调控AnnexinⅡ启动子在转录起始点5’端第34¹24个碱基范围内，但DNA反应元件的精确碱基序列及其调控模式，还有待于进一步的研究。结论：异常高表达的AnnexinⅡ蛋白可促进纤维蛋白溶解酶的生成，导致原发性纤溶亢进，这可能是APL严重出血的主要原因之一，同时，AnnexinⅡ提高了肿瘤细胞的迁移能力，提示AnnexinⅡ可能参与白血病的浸润和转移。PML/RARɑ融合蛋白可以转录激活AnnexinⅡ启动子的活性，在RNA水平上上调AnnexinⅡ的高表达。通过研究急性早幼粒细胞白血病临床出血并发症的关键分子之一AnnexinⅡ的病理生理效应及其调控的分子机制，建立了研究环境毒物致白血病分子发生机制的方法学，为下一步研究环境污染物致白血病的机制打下基础。