Tim-3 (T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3)是2002年发现的新型免疫调节分子,最初因其特异性表达于分化终末期Th1细胞并负调控Th1应答而广受关注。近年研究结果显示,Tim-3除了在Th1细胞上表达外,在细胞毒性T细胞(Tc1细胞)、树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞上均有表达,并且通过影响这些细胞的功能,参与多种疾病的进程。凋亡是机体清除衰老、死亡或损伤细胞的重要机制,凋亡清除异常可以导致多种自身免疫病。同时,凋亡也是机体清除活化免疫细胞、防止细胞过度活化导致免疫病理损伤的重要机制。已有研究证实,Tim-3与其配体相互作用可诱导Th1凋亡,在病毒性肝炎及移植排斥等疾病中保护机体免受免疫损伤。最新研究证实,Tim-3是凋亡信号磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)的受体,可以介导巨噬细胞吞噬凋亡细胞。Tim-3组成性高表达于巨噬细胞,那么Tim-3是否介导巨噬细胞的凋亡,进而参与巨噬细胞调节?Tim-3在具有明显凋亡异常的自身免疫病类风湿性关节炎中的表达如何?Tim-3是否参与类风湿的发生?针对上述问题,本论文开展以下两方面研究：巨噬细胞参与免疫应答的各个环节,不仅在机体抗感染及清除衰老或损伤细胞、维持自身稳定过程中发挥重要作用,而且也可以通过分泌各种炎性因子,介导炎症产生,导致机体损伤。因此,调节巨噬细胞功能,防止巨噬细胞过度活化具有重要意义。活化诱导凋亡(activation induced cell death, AICD)是机体防止免疫细胞过度活化的重要机制。巨噬细胞AICD的机制尚未阐明。单核／巨噬细胞高表达Tim-3,但Tim-3在巨噬细胞AICD中的作用及机制尚未见报道。目的：建立巨噬细胞AICD的细胞模型,研究Tim-3在巨噬细胞活化诱导凋亡中的作用,并探讨其机制。方法：1检测Tim-3在小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞中的表达1.1RT-PCR检测Tim-3 mRNA的表达挑选6至8周周龄的雄性BalBc小鼠,腹腔注射7%的无菌淀粉溶液。72小时后分离其腹腔巨噬细胞。抽提小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,PCR检测Tim-3 mRNA的表达。1.2流式细胞术检测Tim-3蛋白的表达收集新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞或对数生长期RAW264.7细胞,以PE标记的Tim-3抗体或同型对照抗体进行染色,流式细胞仪检测Tim-3蛋白的表达。2小鼠巨噬细胞AICD模型的建立新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞或对数生长期小鼠巨噬细胞系RAW264.7以1×105／ml种板,500μl／孔接种于24孔板,待细胞贴壁后添加刺激。应用终浓度10ng／ml的IFN-γ刺激24小时后,再添加终浓度100ng／ml的LPS共孵育12小时,诱导巨噬细胞的凋亡3 Tim-3阻断实验新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞或对数生长期小鼠巨噬细胞系RAW264.7以1×105／ml种板,500μl／孔接种于24孔板,待细胞贴壁后进行如下刺激：终浓度为5μg／ml的Tim-3阻断性抗体或IgG对照预处理1小时后,同上以IFN-γ和LPS诱导巨噬细胞的凋亡4抑制STAT1磷酸化小鼠巨噬细胞系RAW264.7以1×105／ml种板,500μl／孔接种于24孔板,待细胞贴壁后添加刺激：应用STAT1酸化抑制剂fludarabine6μM或对照PBS预处理30分钟后,添加终浓度为5μg／ml的Tim-3阻断性抗体或IgG对照共孵育1小时,最后同上应用IFN-γ和LPS诱导巨噬细胞的凋亡。5凋亡检测5.1 Annexin-V/PI双染检测凋亡收集待检测的巨噬细胞,加入2mlPBS后,1000rpm,5min离心,弃去上清后,加入1mlPBS进行细胞计数,调整细胞数至5×105,离心后弃去PBS,加入500μl凋亡检测用的缓冲液,混匀后,避光添加FITC标染的Annexin-V 5μl混匀,再添加PI 5μl混匀,室温避光孵育10min,上流式细胞仪检测凋亡。5.2 TUNEL染色检测凋亡预先于24孔板内铺上高压处理的飞片,再种板诱导细胞凋亡。PBS冲洗细胞2次。加入含1μM枸橼酸钠盐的Triton X100 (0.1%)溶液冰上孵育10min,对细胞进行打孔。PBS冲洗后滴加酶标染色液25μl,置入湿盒内37℃避光标染30min,荧光显微镜观察,并保存图像。6 Westen Blot检测p-Ser727-STAT1的表达提取细胞总蛋白,并检测浓度,加入6×loading buffer至1×,混匀,煮沸变性。蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转膜至PVDF膜上。用兔抗鼠p-Ser727-STAT1单克隆抗体作为一抗共孵育1小时,洗膜液洗去一抗,HPR标记的羊抗兔的二抗共孵育1小时,洗涤后,ECL显色液显色。结果1 Tim-3组成性高表达于小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞RT-PCR结果显示,RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞均可扩增出一条明显的Tim-3条带。流式结果显示,小鼠腹腔巨噬细胞和巨噬细胞系RAW264.7细胞表面均存在Tim-3蛋白的表达。小鼠腹腔巨噬细胞Tim-3表达(65.9%)高于RAW264.7(28.1%)2成功建立小鼠巨噬细胞AICD模型在巨噬细胞系RAW264.7中,流式检测结果显示：单独应用IFN-γ或LPS不能诱导RAW264.7细胞凋亡(IFN-γ刺激组凋亡率为2.443±0.090%；LPS组为0.837±0.432%),而联合应用IFN-γ+LPS刺激可显著诱导RAW264.7细胞凋亡(33.54±0.1747%,P<0.05)。TUNEL荧光染色实验显示相同的结果,即单独IFN-γ或LPS刺激组细胞荧光染色率显著低于IFN-γ+LPS联合应用组。同样,利用IFN-γ+LPS联合刺激成功在原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞中诱导了凋亡(IFN-γ组／LPS组vs IFN-γ+LPS联合刺激组凋亡率：1.705±0.995%／1.510±1.210% vs 18.41±0.230%, P<0.05)上述结果显示：IFN-γ+LPS联合刺激可以成功建立巨噬细胞AICD模型。3阻断Tim-3上调小鼠腹腔巨噬细胞和巨噬细胞系RAW264.7的AICD在巨噬细胞系RAW264.7中,流式检测结果显示：Tim-3阻断性抗体预处理可以明显升高IFN-γ+LPS诱导的细胞凋亡(Tim-3抗体预处理组vs IgG对照组：46.29±1.139% vs 34.50±1.657%,P=0.0042)；且Tim-3抗体增强AICD的作用呈现剂量依赖性：随着应用Tim-3阻断性抗体剂量的逐渐升高,IFN-γ+LPS诱导的凋亡率也逐步升高(Tim-3阻断性抗体浓度为0.5、1.5、3.5、5μg／ml时RAW264.7细胞凋亡率分别为36.75±1.100%、41.98±0.4576%、43.07±0.4096%和46.29±1.139%)。TUNEL荧光染色实验获得了类似结果。在原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,Tim-3阻断性抗体同样可以增强IFN-γ+LPS介导的AICD,流式检测结果显示：Tim-3阻断性抗体+IFN-γ+LPS刺激组的细胞凋亡率(29.45±0.350%)明显高于对照IgG+IFN-γ+LPS刺激组(19.63±0.730%)(P=0.0067)。上述结果提示：Tim-3抑制小鼠巨噬细胞AICD。4 Tim-3阻断性抗体上调IFN-γ+LPS刺激引起的RAW264.7凋亡的机制在巨噬细胞系RAW264.7中,Western-blot结果显示,与同型IgG抗体对照组比较,Tim-3阻断性抗体预处理后,IFN-γ+LPS刺激的RAW264.7细胞中STAT1和727位丝氨酸位点磷酸化的STAT1的表达显著升高。该结果提示STAT1 727位丝氨酸位点磷酸化可能参与Tim-3对小鼠巨噬细胞AICD的调控。应用STAT1磷酸化抑制剂fludarabine(终浓度6μM)预处理细胞后,流式结果显示：Tim-3阻断性抗体上调IFN-γ+LPS诱导凋亡的作用消失了,Tim-3抗体处理组vs IgG对照处理组的凋亡率：22.49±0.043%vs26.73±1.430%,P=0.0974,即应用fludarabine预处理后,(Tim-3阻断性抗体+IFN-γ+LPS)刺激组与(对照IgG+IFN-γ+LPS)刺激组的细胞凋亡率的比值(0.8438±0.047)明显低于PBS对照(1.258±0.009)(P=0.0130)。提示：STAT1的磷酸化介导了Tim-3阻断性抗体对巨噬细胞AICD的上调作用。上述结果显示：Tim-3对小鼠巨噬细胞AICD的调控可能通过影响STAT1 727位丝氨酸位点磷酸化来实现。结论本研究成功建立了小鼠巨噬细胞AICD的模型。抗体阻断实验证明Tim-3可以抑制IFN-γ+LPS诱导的巨噬细胞AICD。Westen blot结果和STAT1磷酸化抑制剂的应用后的流式结果,均提示,STAT1 727位丝氨酸位点的磷酸化可能是Tim-3抑制巨噬细胞AICD的重要机制。创新点及意义本研究首次证明Tim-3在巨噬细胞活化诱导凋亡中的作用,并初步探讨了其机制,为深入阐明Tim-3生物学活性及巨噬细胞AICD机制提供了重要实验依据。第二部分Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义巨噬细胞凋亡异常可以导致免疫细胞过度活化,是多种自身免疫病的重要发病机制之一。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA),是一种常见的自身免疫性疾病,致残率高。多种免疫细胞的活化参与了类风湿性关节炎的发生发展。众多研究证实,凋亡与类风湿性关节炎密切相关,免疫细胞在RA中的过度活化或调控失调可能是促进疾病发展的关键环节。Tim-3表达于多种免疫细胞,其参与凋亡调控,在多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)和RA动物模型,胶原诱导的关节炎(collogen induced arthritis,CIA)等自身免疫病中发挥重要作用。人群调查结果显示,Tim-3基因编码区和启动子区多态位点-574T>G和4259G>T的单核苷酸多态性与RA的易感性有关,提示Tim-3与类风湿性关节炎的相关性。本课题首次探究Tim-3分子在类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞上的表达变化及其临床意义。目的：检测Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞上的表达；分析Tim-3表达与疾病活动度的相关性。方法：1流式细胞术检测外周血各细胞亚群上Tim-3的表达收集类风湿性关节炎患者和健康对照者肝素抗凝血,分别标染CD3、CD4、CD8、CD16／56、CD14、Tim-3和各色荧光对照抗体,流式细胞术检测Tim-3在外周血不同细胞亚群中的表达。2血浆肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)检测留取类风湿性关节炎患者血浆,于-80℃保存,ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测TNF-α含量。3实时定量PCR检测外周血单个核细胞IL-17 mRNA表达收集RA患者肝素抗凝血,用淋巴细胞分离液分离患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)。Trizol法抽提总RNA,逆转录成cDNA后,以SYBRgreen荧光探针法进行实时定量PCR检测IL-17 mRNA表达水平。4统计学分析采用GraphPad Prism5软件对实验数据进行Mann-Whitney非参数U检验、Kruskal-Wallis非参数H检验和Spearman相关性分析。P<0.05有统计学意义。结果1、类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞(PBMC) Tim-3表达显著高于健康对照,且Tim-3表达水平与血浆TNF-α含量及疾病活动度负相关流式结果显示RA患者PBMC上Tim-3的表达率(29.38±1.321%)显著高于健康对照(24.50±1.855%)(P=0.0317)。分析PBMC上Tim-3蛋白的平均荧光强度(MFI),得到相似结果,即：RA患者PBMC中Tim-3表达水平(4.926±0.5207)显著高于健康对照(2.907±0.3082) (P=0.0043)。相关性分析显示：RA患者PBMC中Tim-3+细胞比例与血浆TNF-α水平(r=-0.5459,P=0.0070)和疾病活动度指标DAS28(r=-0.4318,P=0.0396)均呈现良好的负相关。2、RA患者外周血各T淋巴细胞亚群和单核细胞上Tim-3的表达均显著升高流式结果显示RA患者外周血各T细胞亚群(CD4+T、CD8+T、NKT细胞)和单核细胞上的Tim-3表达率均显著高于健康对照。(RA患者vs健康对照：CD4+T：12.92±1.182% vs 9.62±0.864%：CD8+T：19.64±1.915% vs 11.70±1.162%；CD14+单核细胞：91.43±3.100% vs 79.25±4.209%；NKT细胞：49.39±2.574% vs37.80±2.579%) (P<0.05)。3、RA患者外周血各T淋巴细胞亚群Tim-3的表达水平均与疾病活动度指标DAS28负相关统计学分析发现,患者DAS28指数与CD4+T、CD8+T和NKT细胞上Tim-3的表达水平呈良好负相关性(CD4+T细胞：r=-0.4375,P=0.0368；CD8+T细胞：r=-0.4234,P=0.0441；NKT细胞：r=-0.5548,P=0.0060)4、RA患者外周血CD4+T淋巴细胞上Tim-3水平与IL-17mRNA表达正相关RA患者CD4+T细胞上Tim-3水平与PBMC IL-17相对表达量呈正相关(r=0.5717,P=0.0068)。5、RA患者CD8+T和NKT细胞Tim-3表达水平与血浆TNF-α浓度负相关RA患者CD8+T细胞和NKT细胞上Tim-3的表达与血浆TNF-α浓度负相关(CD8+T细胞：r=-0.4271,P=0.0474：NKT细胞：r=-0.4874,P=0.0214)。6、经正规治疗后,疾病活动度好转的病人,CD3+T细胞上Tim-3表达上调6例RA患者正规治疗3-6个月后所有6位患者病情均有好转。分别收集6为患者治疗前后PBMC,检测并分析Tim-3表达,流式结果显示,CD3+Tim-3+T细胞的比例较治疗前有升高趋势。(治疗后vs治疗前：23.01±4.214% vs14.25±3.137%,P=0.1261)结论1、RA患者外周血单个核细胞上Tim-3的表达明显高于健康对照；且RA患者Tim-3在T细胞各亚群(CD4+T.CD8+T.CD3+CD16/56+NKT细胞)和单核细胞上的表达均分别高于健康对照。2、RA患者中,PBMC,尤其是各T细胞各亚群(CD4+T、CD8+T、CD3+CD16／56+NKT细胞)上Tim-3表达水平与疾病活动度指标DAS28负相关。3、RA患者中,Tim-3在CD4+T细胞上的表达率与IL-17mRNA的表达呈良好正相关,Tim-3可能是通过抑制CD4+T细胞活性,来中和Th1细胞对IL-17产生的抑制作用；PBMC尤其是CD8+T和NKT细胞上Tim-3的表达率与血浆TNF-α水平负相关。提示了Tim-3可能是通过抑制T细胞活性调控细胞因子的表达来参与疾病炎症反应。创新点及意义本研究首次发现类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞及外周血T细胞各亚群上Tim-3表达显著上调且与疾病活动度负相关,为证实Tim-3参与RA的发生发展提供了重要依据,并提示Tim-3分子有可能作为一种反应RA疾病转归的新指标。统计学分析发现RA患者中T细胞各亚群Tim-3表达与炎症相关重要细胞因子IL-17、TNF-α相关,提示Tim-3分子可能通过调节T细胞分泌细胞因子参与RA发生,为阐明RA发生机制提供了新论据。