论文部分内容阅读
论文对新鉴定鸭肠炎病毒UL45基因(Gen Bank登录号EU195107)进行了生物信息学分析,原核表达并制备了UL45基因去跨膜区(UL45基因的295-675bp,命名为UL45Δ)蛋白的多克隆抗体,利用该抗体对UL45部分生物学特性进行了研究,主要内容可归纳如下：1.DEV UL45基因的分子特性分析DEV UL45基因大小为675bp,编码224aa,等电点为6.51。UL45蛋白没有信号肽,有一个较大的跨膜区,阈值为0.5时共有13个潜在的磷酸化位点,包括色氨酸(Serine)8个,苏氨酸(Threonine)4个,酪氨酸(Tyrosine)1个。推测可能的B细胞表面抗原位于13～17,20～28,40～47,51～56,157～161和202～206位氨基酸,主要的T细胞表面抗原位于68～73,130～133和157～160位氨基酸。序列比对分析表明DEV CHv UL45与禽疱疹病毒氨基酸同源性较其他疱疹病毒高。密码子偏嗜性分析表明UL45基因偏嗜性不强,异源表达量较低,最适合于大肠杆菌表达系统。2.DEV UL45去跨膜区的原核表达及多克隆抗体的制备成功构建了UL45全基因和去跨膜区的重组原核表达质粒(pET-32-UL45和pET-32-UL45Δ),并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS菌中。IPTG诱导结果表明UL45全基因不能有效表达,去跨膜区的UL45Δ基因高效表达,得到大小约为33kDa的可溶蛋白,与预期蛋白大小一致。优化的最佳表达条件为0.2mmol/L IPTG,30℃诱导4h。重组蛋白纯化后用于制备兔抗UL45Δ抗体,琼脂糖扩散试验表明其效价为1：32,免疫印迹结果表明抗体能特异性的识别UL45Δ蛋白,并且证明UL45基因是DEV基因组的组成部分。3.DEV UL45基因转录特性研究本研究用荧光定量PCR方法对DEV感染宿主细胞后病毒UL45基因mRNA表达水平的变化进行了动态分析。结果表明,感染后0-18h,UL45基因处于低转录水平,24h后转录产物量迅速增加,到42h达到高峰后有所下降,并一直持续到感染后72h。推测DEV UL45基因属于晚期基因。4.UL45基因编码蛋白属性分析利用超速离心机得到纯化的DEV,并用去垢剂NP-40萃取纯化病毒,破碎病毒结构,得到上清(囊膜蛋白和极少数皮层蛋白)和沉淀(大多数皮层蛋白和衣壳蛋白)。通过对纯化病毒和得到的上清、沉淀进行免疫印迹分析,结果表明UL45蛋白存在于纯化病毒和上清中。推测UL45蛋白是病毒的囊膜蛋白。