心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是目前全球范围内导致患者死亡的最主要因素之一。冠状动脉类疾病（coronary artery disease,CAD）是心血管疾病中的一种,其致病机理为:由于血管内皮功能障碍引发血管损伤或血管功能丧失,造成心脏的血液灌注减少,最终引发心肌缺血甚至心肌梗塞。但是传统的药物针对该类疾病的治疗具有很大局限性,因此细胞移植治疗成为相关医疗及科研人员的关注点。胚胎干细胞（embryo stem cell,ESCs）和诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell,i PSCs）是细胞移植治疗的种子细胞来源。但是ESCs的临床应用涉及到医学伦理问题和异体移植后的免疫排斥风险,i PSCs的应用将为心血管疾病的治疗提供便利。目前,很多研究人员对i PSCs向血管内皮细胞的定向分化进行了探索,相关研究主要集中在小鼠和人上。猪作为一种重要的农用家畜,其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性,猪的寿命又相对较长,因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型。对于猪诱导多能性干细胞的建系、培养及定向分化为血管内皮细胞体系的研究将为创建猪心血管疾病模型提供保障。目前,很多研究组通过不同的方法建立了猪i PS细胞系,但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究少之又少。2013年,Gu等首次报道了将猪脂肪间充质来源的i PSCs诱导分化为内皮细胞的方法,但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径,培养液成分也相对复杂。针对上述问题,我们进行了以下四部分研究:（1）使用无血清单层细胞诱导的方式对四种猪多能性干细胞系（猪胚胎来源的干细胞系Penk6和Pe WCHX,猪诱导多能性干细胞系Pilw4和M10）进行诱导分化,并检测细胞分化前期谱系特异性基因的表达趋势,从而筛选出中胚层分化潜能最高的猪多能性干细胞系;（2）使用不同的细胞因子或化学小分子组合对上述细胞进行诱导,筛选出促进细胞向中胚层分化的最优组合;（3）优化上述培养体系,建立一种无血清无饲养层的猪i PSCs向血管内皮细胞定向分化的诱导方法;（4）使用上述方法分别诱导人和猪的多能性干细胞向内皮细胞分化,并比较二者分化进程中的差异。研究结果表明,猪胚胎来源的Penk6和Pe WCHX细胞系在诱导分化过程中细胞形态无明显变化,猪诱导多能性干细胞M10和Pilw4在诱导分化过程中失去克隆形态并有部分细胞死亡。谱系特异性基因的表达检测结果显示,Penk6、Pe WCHX和M10细胞没有启动向原条期的分化且中胚层标记基因的表达变化无规律,Pilw4细胞的原条期、内胚层以及中胚层标记基因的表达水平均是先提高后下降,说明该细胞启动了分化进程。据此,我们选择猪诱导多能性干细胞系Pilw4进行后续实验。首先,我们使用四种前人报道的诱导人ESCs向血管内皮细胞分化的单层培养方法对pi PSCs进行定向诱导,在其中选择能够有效促进pi PSCs向中胚层分化的方法用于后续实验。接下来,我们对上述方法进行优化并研究了CHIR99201和BMP4在诱导分化前期的作用。实验根据第0至4天的不同处理方案分为6组进行:F,在第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2;FB,第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2和BMP4;BFB,第0至2天添加BMP4、第3至4天FGF2和BMP4;CF,在0至2天添加CHIR99201、3至4天添加FGF2;CFB,在0至2天添加CHIR99201,第3至4天添加FGF2和BMP4;CBFB,在第0至4天添加CHIR99021和BMP4,第3至4天添加FGF2和BMP4。上述6组从第5天开始处理一致:第5至7天培养液中添加VEGF和BMP4,8至10天换用商品化的内皮细胞培养液进行培养,第11天对细胞进行流式分选以及血管内皮细胞鉴定。实验结果显示,F、FB、BFB三组在诱导分化前期原条期标记基因的表达水平很低,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比仅为3.12%-5.16%;CF、CFB、CBFB三组在诱导分化前期原条期和内胚层标记基因的表达水平先上升后下降,中胚层标记基因表达水平持续上升,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比均高于12%,其中实验组CFB,CBFB的CD31阳性细胞率分别为21.3%和17.1%。以上结果表明,CHIR99201在pi PSCs向血管内皮细胞分化的前期具有促进作用,在诱导分化中期添加BMP4能够显著提高血管内皮细胞的诱导效率。此后,我们利用优化后的诱导步骤,从pi PSCs中获得了血管内皮细胞,该细胞具有与猪主动脉血管内皮细胞（AOCs）相似的形态、基因表达模式和功能特征。此外,我们使用相同的诱导步骤对人胚胎来源的干细胞进行诱导分化,结果表明人胚胎干细胞的分化效率远低于pi PSCs的分化效率,这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关。综上所述,我们建立了一种无血清的不依赖于饲养层的单层细胞诱导分化方法,可以将猪诱导多能性干细胞定向分化为具有功能的血管内皮细胞。该研究为评价大动物体内血管内皮细胞自体移植效果以及创建猪心血管疾病模型提供了可能。