论文部分内容阅读
纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶(endo-glucanase),外切葡聚糖酶(exoglucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase),这三种酶将纤维素最终转化成为葡萄糖。近年来随着纤维素酶广泛应用,细菌纤维素酶制剂也越来越受到人们的重视,然而,纤维素酶大规模应用及生产中受到酶活较低以及成本较高的限制。本文利用基因工程手段实现了对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切葡聚糖酶基因和来源于真菌Corticium rolfsii(Strain AHU9627)的内切葡聚糖酶基因进行了同源和异源结构域重构并分别在大肠杆菌(BL21)和毕赤酵母(GS115)中进行表达,同时对其表达产物进行了相关的酶学性研究。1.以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切葡聚糖酶基因序列(GenBank Accession:DQ782954)为模板设计引物,根据生物信学方法对其编码的蛋白质序列的蛋白质结构分析表明,该内切葡聚糖酶的活性中心部位由一个长约82aa的底物结合结构域(CBD)和一个长约253aa的催化结构域(CD)组成,中间有55aa的链接肽(CP),并在NCBI上分析来源于真菌Corticium rolfsii(Strain AHU9627)的内切葡聚糖酶基因,对其蛋白质的活性位点进行分析,分析得出其来源于AHU9627纤维素酶基因的结合结构域及连接肽区域(命名为FCBD)的编码序列GenBank Accession No.:D49448,分别设计带有相应酶切位点的各片段引物并由英骏公司合成。采用PCR技术扩增得到各目的片段。成功构建了在原始基因上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域(命名为FCBD)的编码序列,将去除信号肽的原始基因和增加FCBD的重构基因成功地构建了pET32a载体,并转化至大肠杆菌表达菌株(Escherichia coli)BL21。分别命名为pET32a/EG和pET32a/EG/FCBD,筛选获得阳性菌落重组转化子,刚果红染色检测其内切葡聚糖酶活性,经1mmol/L的IPTG诱导4-6h,最高酶活分别可达到94.38978 U/mL和174.3079U/mL,SDS-PAGE电泳分析pET32a/EG和pET32a/EG/FCBD两重构体酶分子量大小为72KD和80KD。酶活性比较显示增加了来源于真菌的FCBD结构的重构体pET32a/EG/FCBD酶的活性是对照菌株pET32a/EG的1.8倍。酶学性质分析表明：两种酶的最适反应温度并无太大差别,均为60℃,最适pH值为分别为6.5和7.0,在30℃-75℃和pH4.5-pH10.0处理后其残余酶活均能达到最高酶活的50%以上。2.本实验成功构建了在原始基因上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域的(命名为FCBD)编码序列、以及删除糖结合模块上增加来源于AHU9627纤维素酶基因的结构域及连接肽区域的(命名为FCBD)编码序列,并将其成功插入pPIC9k表达载体上,分别构建了pPIC9k/EG/FCBD, pPIC9k/CD/FCBD重组载体。将重组表达载体经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,用酶活测定的方法,得到高酶活工程菌,命名为9KEGF和9KCDF,并将其与实验室已经构建的去掉信号肽(EG1)、增加催化域(EG2)、糖结合模块(EG3)以及删除糖结合模块(EG4)的内切葡聚糖重构酶基因转入毕赤酵母中获得高酶活转化子的工程菌株同时进行诱导表达,酶学性质分析结果显示,EG1、EG2、EG3、EG4的最适反应温度分别为45℃、55℃、40℃、55℃、55℃、40℃,其酶活最高分别达到885U/mL、770U/mL、797U/mL、918U/mL、779/mL；、874/mL。最适pH有一定的差别,EG1和EG2的最适pH为pH=7.0,EG3、EG4和9KCDF有共同的最适pH,为pH=5.6;9KEGF的最适pH为6.5.温度稳定性没有太明显的差异,在温度为70℃时,EGl和9KEGF的酶活可达到最高酶活的70%以上,EG4和9KCDF酶活可达最高酶活的60%以上,但在此温度下,EG2和EG3酶活下降很明显,分别只达到最高酶活的13.8%和21%。六株重构体酶均表现出较强的碱耐受性,但其保持在最大酶活的80%以上时其pH大至都在pH=6.5-8.0之间,随着pH值的进一步增加,其酶活均有降低,EG2在pH=10时酶活出现明显的降低,其达五株重构体酶,在pH=10时,酶活均能保持在最高酶活的60%以上。