目的：细胞周期调节紊乱在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及其与上、下游基因形成的信号通路可影响能量代谢、自噬、细胞周期调控等过程，与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关。近年来，食管腺癌(EAC)的发病率剧增，因其总体预后较差，具有广泛浸润及远处转移等重要特征，故目前主要采取包括放疗在内的多学科综合治疗。然而，这种治疗模式存在诸多副作用，寻求高效低毒药物、提高放疗效果，成为近年来食管癌治疗领域的研究热点。作为一种具有多重药理学活性的多酚类化合物，白藜芦醇(RSV)的抗肿瘤作用及分子机制已引起广泛关注。本研究应用RSV作用于两种食管腺癌细胞系（OE33和OE19），观察其对细胞增殖、迁移能力及放射敏感性的影响，并探讨其作用机制。　　方法：①MTT比色法及BrdU掺入法评价RSV对EAC细胞增殖、DNA合成的影响；②贴壁实验、划痕试验及穿孔试验评价RSV对EAC细胞浸润、迁移能力的影响；③Western blot法测定AMPK蛋白、磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)、p27Kipl蛋白、P-p27Kipl蛋白、S期激酶相关蛋白2(Skp2)水平，特异性荧光多肽底物(Suc-LLVY-AMC)评价26S蛋白酶体活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测RSV对EAC细胞p27Kipl mRNA表达水平的影响;流式细胞术分析细胞周期分布变化，以探讨RSV影响EAC细胞增殖、浸润及迁移能力的机制；④通过细胞克隆形成实验检测EAC细胞存活率，按多靶单击模型拟合细胞存活曲线，计算反映放射敏感性的指标，包括2Gy时的细胞存活分数(SF2)、平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)和放射增敏比(SER)，以评价RSV对EAC细胞的放射增敏作用；⑤通过流式细胞仪分析单独X线照射(IR)和IR联合RSV对EAC细胞周期分布的影响，Western blot法半定量分析KU80蛋白、KU70蛋白、RAD51蛋白的变化，阐明RSV放疗增敏的机制。　　结果：⑴MTT比色法和BrdU掺入法显示:RSV抑制体外培养的OE33、OE19细胞生长及DNA合成，随药物浓度的增高及作用时间的延长，细胞的抑制率逐渐升高，两种细胞在24 h的IC50分别为94.83μ M、97.07μ M；⑵不同浓度RSV作用后，OE33、OE19细胞形态不规则，体积明显缩小，并可见核染色质凝聚，核固缩等表现；⑶RSV作用于OE33、OE19细胞，细胞的贴壁能力随药物浓度的增高而逐渐减弱；⑷细胞划痕试验及穿孔试验结果显示，OE33、OE19细胞在RSV作用下，其侵袭、迁移能力随药物浓度的增高而逐渐减弱;0、50、100μM RSV作用后，穿膜的OE33细胞数均值分别为196.13、67.25和25.38，穿膜的OE19细胞数均值分别为205.61、73.36和29.63，差异有显著性；⑸流式细胞术分析表明:RSV可使G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少;单独X线照射(TR) OE33、OE19细胞使存活分数呈剂量依赖性下降，并出现G2/M期阻滞，S期细胞明显减少;50μM RSV处理24h可逆转IR引起的G2/M期阻滞；⑹应用western blot法和BrdU掺入法分析显示:EAC细胞中磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)水平随RSV的浓度增加而增加，总AMPK的水平及蛋白表达未见增加;AMPK蛋白抑制剂（复合物C）或转染AMPKα siRNA，可逆转RSV对DNA合成的抑制作用；⑺应用western blot法及RT-PCR分析显示:RSV能显著增加OE33细胞p27Kipl蛋白水平，但未改变p27Kipl mRNA水平;以复合物C预处理或转染AMPKαsiRNA，均可逆转RSV诱导的p27Kipl蛋白增加和细胞生长抑制，而未改变p27KiplmRNA水平，这表明RSV对p27Kipl蛋白的调控过程是AMPK依赖性的，而不是p27Kipl基因依赖性的；⑻AMPK激活剂(AICAR)和AMPK抑制剂（复合物C）均未改变P-p27Kipl占总p27Kipl蛋白(T-p27Kipl)的比率，并且蛋白酶体抑制剂MG132可完全阻断复合物C对p27Kipl蛋白稳定性的影响，这表明AMPK对p27Kipl的调控作用并非通过蛋白磷酸化而实现，抑制AMPK的活性时，26S蛋白酶体的活性上调而加速p27Kipl蛋白的降解；⑼特异性荧光多肽底物检测法显示:RSV显著降低EAC细胞中26S蛋白酶体活性，以复合物C预处理或转染AMPKα siRNA，均可逆转这种效应。由此可见，RSV是通过调控26S蛋白酶体通路（而不是基因转录变化）使p27Kipl蛋白水平升高；⑽Skp2作为一种泛素-E3连接酶，对各种细胞26S蛋白酶体依赖性p27Kipl蛋白的泛素化降解起主要限速调节因子的作用。RSV可使OE33细胞Skp2蛋白水平下调，而复合物C预处理或AMPKα siRNA转染可“抵消”RSV引起的Skp2蛋白水平降低，这表明RSV通过活化AMPK下调Skp2蛋白水平；⑾BrdU掺入法显示，以p27Kipl siRNA转染EAC细胞，可“抵消”AICAR或RSV对细胞生长的抑制效应，证实RSV或AICAR可“活化”AMPK蛋白、下调p27Kipl蛋白水平，抑制细胞增殖；⑿细胞克隆实验结果:相同照射剂量下，EAC细胞的存活分数随RSV浓度的升高而降低，相同浓度RSV，细胞的存活分数随照射剂量的升高而降低;随沙利度胺浓度的增加，EAC细胞的D0、Dq、SF2值均逐渐减小，SEED0逐渐增大，说明RSV对EAC细胞具有放射增敏作用，呈浓度依赖性；⒀应用Wwestern blot法分析显示:RSV可以使EAC细胞中RAD51蛋白（主要参与同源重组修复）表达下调，RSV联合X线照射组RAD51显著下调，KU80、KU70无显著变化，而单独X线照射细胞RAD51、KU80及KU70均无显著变化。因此，抑制RAD51蛋白表达可能是RSV增强EAC细胞放射敏感性的机制之一。　　结论：①白藜芦醇抑制体外培养的食管腺癌细胞增殖、迁移及转移，是由于AMPK蛋白磷酸化导致26S蛋白酶体依赖性的p27Kipl蛋白增加，进而引起细胞周期重分布，即G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少。②白藜芦醇对食管腺癌细胞具有放射增敏作用，其机理可能为：直接抗癌活性；解除放疗诱导的G2/M期阻滞；下调DSB同源重组修复蛋白RAD51，干扰放疗后DNA损伤的修复。