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研究背景:激素性股骨头坏死（Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH）是骨科最常见疾病之一,在非创伤性股骨头坏死（Nontraumatic Osteonecrosis of Femoral Head,NONFH）的发病率中占首位。由于糖皮质激素在临床上的广泛应用、不恰当使用,以及糖皮质激素治疗的不可替代性,使其已成为非创伤性股骨头坏死的首要危险因素。目前,髋关节置换是激素性股骨头坏死最终阶段治疗的唯一选择。激素性股骨头坏死具有高致残率,给患者健康带来严重损害,也造成了沉重的家庭及社会经济负担,因此探索SONFH的发病机制、干预SONFH的进展、找到新的治疗方法具有重要意义。尽管目前已经提出了关于该疾病发病机理的许多假说,包括脂质代谢障碍,血管内凝血,细胞凋亡,微循环损伤和骨内压增高等,但关于激素性诱导的股骨头坏死的确切机制仍然不清楚。在所有报告的风险因素中,氧化应激障碍与激素性股骨头坏死的发生发展关系密切。硒（Se）是人体必须的微量元素,研究发现,硒（Se）在抑制氧化应激中起重要作用,并已被证明Se可有效降低氧化应激对DNA的损伤。此外,在一些特殊情况下,Se缺乏可直接诱导氧化应激和内质网应激,引起氧化应激损伤。因此Se作为良好的抗氧化剂具有很大的潜力应用于临床治疗。然而,Se元素的应用窗口狭窄,严重制约了其治疗效果的发挥。随着纳米技术的快速发展,通过纳米技术改性后的纳米Se,可以极大程度上降低Se的毒性风险,增加其作为药物治疗疾病的可能。本实验研究中所用的多孔纳米复合材料Se@SiO2就是一种新型的纳米材料,实验证明其生物相容性良好,是Se安全和理想的来源。不仅如此,多孔结构,使其具有控制释放能力,可以在长时间内缓慢释放有益量的Se,同时相比已有的抗氧化剂,其较高的性价比,出色的稳定性,以及其缓释所带来的长效性,使其具有极大的治疗激素性股骨头坏死的应用潜力,为SONFH的治疗开辟了新途径。研究目的:1.建立并评估激素性股骨头坏死大鼠模型;2.提取培养软骨细胞,在体外实验中研究多孔纳米复合材料Se@SiO2的抗氧化应激能力及其对软骨细胞受到氧化应激时的保护作用。3.通过动物实验对多孔纳米复合材料Se@SiO2治疗激素性股骨头坏死的疗效进行研究评估。方法:1.大鼠激素性股骨头坏死模型的建立及评估:取12只SPF级,12周龄,雄性SD大鼠,随机分为2组,实验组8只,对照组4只。称重后,腹腔注射脂多糖20ug/kg 2次,每次间隔24小时,24小时后肌注甲基强的松龙琥珀酸钠（MPS）,20mg/kg,连续注射3次,每次间隔24小时。对照组给予相同部位注射相同剂量的生理盐水。连续饲养8周后,取材双侧股骨头,放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时。分别行MicroCT扫描,HE染色,对股骨头坏死情况进行检测评估。2.软骨细胞的培养和鉴定:取3-4周龄SD大鼠,80-100g,麻醉处死,75%酒精浸泡5min,无菌条件下游离出双侧膝关节和髋关节软骨,置于无血清培养基中,将附着韧带、结缔组织膜去除干净。使用显微剪将软骨剪碎至1mm大小,加入3%二型胶原酶,放入37℃培养箱,孵育45min,之后加入5倍体积无血清培养基,37℃孵育12h。消化结束后,加入完全培养基中和,吸入离心管1000r/m离心3min,弃上清后使用完全培养基（10%FBS,DMEM/F-12,1%双抗）重悬后,过滤网,种于T75培养瓶内。隔天换液,约6-7d进行传代。实验使用软骨细胞为4-5代细胞,使用前用Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定,同时将取下的软骨小块,EDTA脱钙后石蜡包埋,切片行甲苯胺蓝染色鉴定。3.多孔纳米复合材料Se@SiO2抑制氧化应激能力检测（ROS抑制实验）:使用ROS检测试剂盒（碧云天）。将软骨细胞接种到6孔板（1×106个细胞/孔）中,分对照组和实验组两组,在实验组细胞的培养液中加入浓度为40μM的多孔纳米复合材料Se@SiO2,预刺激24小时。对照组不添加。然后在每组培养液中加入含有50μM H2O2的PBS 1.5ml,刺激平板中的细胞,放入37℃,5%CO2的培养箱中30分钟,之后用PBS洗涤2次后加入工作浓度的DCFH-DA。在37℃下染色15分钟后,用荧光显微镜观察平板细胞拍照记录。4.多孔纳米复合材料Se@SiO2对软骨细胞氧化应激的保护作用的实验:使用TUNEL试剂盒（Roche,USA）,根据试剂盒说明书操作。将培养的软骨细胞分为H2O2组（对照组）,H2O2+Se@SiO2组（实验组）。实验组的细胞培养液中加入浓度为4μM的多孔纳米复合材料Se@SiO2,预刺激24小时。之后用200μM H2O2刺激实验组和对照组,继续培养24小时,然后用4%多聚甲醛固定细胞15min,PBS洗涤3次,每次5min,Triton X-100透化2分钟。然后将样品在50μLTUNEL反应混合物中于37℃下避光孵育1小时,DAPI染核,荧光显微镜观察记录。细胞凋亡率为视野中TUNEL染色阳性细胞的数目与总细胞数的比值,共数20个视野进行统计学分析。5.多孔纳米复合材料Se@SiO2治疗激素性股骨头坏死的动物实验。取36只SPF级,12周龄,雄性SD大鼠,随机分为3组,每组12只:对照组（A组）、单纯激素诱导组（B组）、激素诱导+多孔纳米复合材料Se@SiO2治疗组（C组）。所有动物适应性饲养一周。B组、C组第一天,腹腔注射脂多糖20ug/kg,注射2次,每次间隔24小时,24小时后肌注甲基强的松龙琥珀酸钠（MPS,美国,辉瑞）,40mg/kg,连续注射3次。在最后一次注射MPS7天后,C组给予腹腔注射1mg/kg的多孔纳米复合材料Se@SiO2,间隔24小时,连续注射14天,B组给予注射等剂量的生理盐水。A组在相同部位、相同时间均给予等剂量的生理盐水。第一次给药后第8周,同时麻醉处死所有组SD大鼠,取双侧股骨头标本,放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上。然后,将样品行Micro CT扫描和HE染色试验。结果:1.SD大鼠激素性股骨头坏死建模实验结果:模型组Micro CT分析显示模型组股骨头出现囊变坏死区域,CT三维参数分析显示模型组骨密度、骨小梁厚度、骨小梁分离度等参数明显低于对照组。HE染色可观察到骨小梁断裂、骨髓坏死、空骨陷窝形成,脂肪细胞数目增多、增大,部分融合成泡状。2.软骨细胞培养鉴定结果:提取的所用的软骨组织甲苯胺蓝染色阳性,细胞Ⅱ型胶原荧光染色阳性。3.多孔纳米复合材料Se@SiO2抑制氧化应激能力检测（ROS抑制实验）结果:ROS表达由DCFH的荧光强度指示（绿色）。H2O2干预后,实验组软骨细胞经过多孔纳米复合材料Se@SiO2的预刺激ROS的表达明显低于对照组。4.多孔纳米复合材料Se@SiO2对软骨细胞氧化应激的保护作用的实验结果:TUNEL染色阳性的绿色荧光亮点为损伤凋亡的细胞。单纯H2O2刺激组检测到大量绿色荧光亮点;而多孔纳米复合材料Se@SiO2干预组检测到极少绿色荧光亮点,统计学分析结果P<0.05,有统计学差异。5.多孔纳米复合材料Se@SiO2治疗激素性股骨头坏死的动物实验结果:HE结果显示B组（模型组）可明显观察到骨小梁断裂、空骨陷窝形成、骨髓坏死,脂肪细胞肥大、增多。C组（多孔纳米复合材料Se@SiO2组）较B组骨质破坏明显减轻,介于A组（对照组）和B组之间。Micro CT扫描图和三维数据统计学分析均显示:股骨头坏死严重情况B组>C组>A组。结论:1.实验中提取培养的细胞为软骨细胞;2.多孔纳米复合材料Se@SiO2具有良好的抗氧化应激能力,3.多孔纳米复合材料Se@SiO2能保护软骨细胞降低氧化应激损伤;4.脂多糖（LPS）联合甲基强的松龙琥珀酸钠（MPS）建立大鼠激素性股骨头坏死模型的方法,成功率高,安全可行;5.多孔纳米复合材料Se@SiO2通过抗氧化应激作用,可以治疗激素性股骨头坏死。