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恶性胶质瘤具有浸润性生长,与脑组织无明确分界,难以彻底切除,易复发的特点。目前手术治疗、放疗及化疗等传统治疗方法对恶性胶质瘤的治疗效果较差,而免疫治疗由于其毒副作用小、特异性高及相对安全等优点,为恶性脑胶质瘤的治疗开辟了新的途径。肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的一种重要手段。它是通过将肿瘤相关抗原(Tumor-associatedantigens,TAAs)以多种形式导入患者体内,激活患者自身的免疫系统,诱导机体细胞免疫和体液免疫反应,从而达到抑制肿瘤生长或清除肿瘤的目的。肿瘤抗原的鉴定及选择对肿瘤疫苗的制备以及其疗效的发挥将起到非常重要作用。AIM-2 抗原(Antigen isolated from immunoselected melanoma-2,AIM-2)是在人黑色素瘤中发现的一种突变蛋白,其抗原表位一段氨基酸序列为RSDSGQQARY的十肽,即AIM-2小肽。研究表明AIM-2抗原在恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、子宫癌、结肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞中特异性表达,而在正常细胞中不表达。因此,AIM-2抗原的抗原表位AIM-2小肽可以作为一个肿瘤免疫治疗靶点,应用于恶性胶质瘤及其他肿瘤的免疫治疗研究。化学合成的小肽在机体内容易降解并且免疫原性弱,免疫效果较差。因此,通过选择合适免疫载体呈递肿瘤抗原小肽,以达到提高肿瘤抗原小肽的免疫原性以及呈递抗原小肽的拷贝数就显得非常关键。目前常用的免疫载体有病毒载体和类病毒颗粒(Virus-like particles,VLPs)。常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒等。腺病毒作为免疫载体具有免疫原性强,可以插入多个外源基因,安全性高及不整合到基因组等优点,应用非常广泛。腺病毒衣壳表面含有240个六邻体蛋白(Hexon),将外源小肽插入Hexon的HVR5区,可以将外源小肽高拷贝的展示在病毒颗粒表面。因此,将AIM-2小肽插入腺病毒Hexon,不仅可以高拷贝的将AIM-2小肽呈现在腺病毒颗粒表面,而且可以针对AIM-2小肽诱发良好的免疫应答反应。常见的类病毒颗粒有人乳头状瘤病毒颗粒、乙肝病毒核心蛋白类病毒颗粒及丙肝病毒类病毒颗粒等。乙肝病毒核心蛋白类病毒颗粒(HBc-VLPs)由180或240个核心蛋白(Hepatitis B virus core protein,HBc)单体自行组装成二十面体的类病毒颗粒结构,其自身具有很强的免疫原性。抗原小肽插入HBc-VLPs表面突起顶端的免疫显性区域,可以将抗原小肽高密度的展示在HBc-VLPs的表面,诱发良好的针对抗原小肽的免疫反应。因此,HBc-VLPs可以作为AIM-2小肽的免疫载体,增强AIM-2小肽疫苗的免疫效果。综上所述,本课题选取了 AIM-2小肽作为免疫抗原,使用腺病毒和乙肝病毒核心蛋白类病毒颗粒作为免疫载体,制备了五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗,然后通过恶性胶质瘤小鼠动物模型评估五种AIM-2小肽肿瘤疫苗对恶性胶质瘤的免疫治疗效果,从而为恶性胶质瘤疫苗的设计及其免疫治疗方案的选择提供新思路,新策略。本课题具体研究内容包括以下几个方面:1.五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗的制备:通过分子生物学方法,将AIM-2小肽基因连入相关腺病毒质粒载体,获得插入AIM-2的腺病毒质粒载体。将其用Pac Ⅰ线性化后转染HEK 293细胞,包装扩增腺病毒,采用CsCl密度梯度离心法进行纯化。2.基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗在恶性胶质瘤免疫治疗的研究。(1)AIM-2小肽肿瘤疫苗在小鼠体内免疫效果的评估:实验选取正常雌性昆明鼠,通过肌肉注射免疫接种肿瘤疫苗,加强免疫两次,每次免疫接种间隔2周,每次免疫剂量为2×1010vp/只,通过ELISA评估每次免疫后昆明鼠体内针对AIM-2小肽的抗体产生情况。(2)根据AIM-2蛋白(AIM-2 protein,pAIM-2)的氨基酸序列,设计合成pAIM-2的引物,通过引物退火合成pAIM-2片段。将pAIM-2片段连入慢病毒载体,制备慢病毒,然后将制备的慢病毒用于构建稳定表达外源pAIM-2的小鼠神经胶质瘤细胞系(pAIM-2/G422)。以pAIM-2/G422细胞作为靶细胞,研究肿瘤疫苗对恶性胶质瘤的免疫治疗效果。(3)AIM-2小肽肿瘤疫苗在恶性胶质瘤小鼠动物模型中的免疫治疗研究:对完成三次免疫后的昆明鼠的右侧后肢皮下接种pAIM-2/G422细胞,接种细胞数量为1×106/只。接种肿瘤细胞后连续测量肿瘤生长大小,绘制昆明鼠荷瘤后肿瘤生长曲线,最后处死昆明鼠,取出肿瘤组织并称重,以此评估AIM-2小肽肿瘤疫苗对肿瘤生长的影响。本研究所取得的结果如下:1.成功获得五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗,分别为:(1)E1 区表达 HBc-AIM-2 的腺病毒:Ad5-E1-CMV-HBc-AIM-2/E3-CMV-Luciferase-T2A-eGFP,滴度为 1.13×1012vp/mL;(2)Hexon 插入 AIM-2 的腺病毒:Ad5-HVR5-AIM-2/E3-CMV-Luciferase-T2A-eGFP,滴度为 0.7×1012vp/mL;(3)E1 区表达 HBc-AIM-2 且 Hexon 插入 AIM-2 的腺病毒:Ad5-E1-CMV-HBc-AIM-2/HVR5-AIM-2/E3-CMV-Luciferase-T2A-eGFP,滴度为 1.43 ×1012vp/mL;(4)E1 区表达并分泌 HBc-AIM-2 的腺病毒:Ad5-E1-CMV-H1H2-HBc-AIM-2/E3-CMV-Luciferase-T2A-eGFP,滴度为 1.3×1012vp/mL;(5)E1区表达并分泌HBc-AIM-2且Hexon插入AIM-2小肽的腺病毒:Ad5-E1-CMV-HIH2-HBc-AIM-2/HVR5-AIM-2/E3-CMV-Luciferase-T2A-eG FP,滴度为 1.2×1012vp/mL。2.五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗三次免疫昆明鼠后,均可以诱发昆明鼠产生针对AIM-2小肽的特异性体液免疫应答,各株AIM-2小肽肿瘤疫苗诱发产生的针对AIM-2小肽的抗体水平存在一定差异,其中E1区表达并分泌HBc-AIM-2且Hexon插入AIM-2的腺病毒的免疫效果最佳。3.在恶性胶质瘤动物模型的实验治疗研究中,五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗对恶性胶质瘤的生长均具有抑制作用,但它们对肿瘤的抑制效果存在一定的差异。其中E1区表达并分泌HBc-AIM-2且Hexon插入AIM-2小肽的肿瘤疫苗的治疗效果最佳,肿瘤生长速度最慢,实体瘤体积明显小于其他实验组;E1区表达HBc-AIM-2且Hexon区插入AIM-2的腺病毒对肿瘤的抑制效果次之,而E1区仅表达HBc-AIM-2的腺病毒对恶性胶质瘤生长的抑制作用最弱。综上所述,本课题设计并获得了五株基于腺病毒载体的AIM-2小肽肿瘤疫苗,这些AIM-2小肽肿瘤疫苗免疫小鼠后可以诱发机体产生强烈的特异性免疫应答,产生针对AIM-2 小肽的抗体,并且对小鼠体内恶性胶质瘤的生长具有抑制作用。其中,E1表达并分泌HBc-AIM-2且Hexon区插入AIM-2的腺病毒的免疫治疗效果最佳。本实验为探究AIM-2小肽疫苗在恶性胶质瘤的免疫治疗及临床治疗研究奠定了基础。