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麻疯树(Jatropha curcas L.)又被称作羔桐、黄肿树、小桐子、臭油桐,系大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)的落叶灌木或者小乔木,由于其果实中较高的含油率,使其成为了国内主要发掘的绿色无污染能源的植物,同时也是世界公认的最有可能成为未来替代化石能源和具有巨大开发潜力的树种。然而,由于麻疯树种子产量低,经济效益差,这严重阻碍了其大规模种植和发展;而雌雄花比例低是其中关键因素之一。研究表明,赤霉素在植物花发育上有着重要的调控作用,同时能够调节雌雄花的比例;转录组数据分析发现,JcGAST1——一个赤霉素信号途径下游组分,在雌雄花中差异表达,可能参与了麻疯树花发育。因此,本文从分子生物学技术方面研究JcGAST1在麻疯树花发育中的作用,进而更好的了解该基因在麻疯树花发育机制中的作用和影响。本实验以JcGAST1为研究对象,克隆其c DNA全长,构建JcGAST1原核表达体系,鉴定其原核表达产物,分析预测JcGAST1蛋白的结构特点,研究JcGAST1基因在麻疯树花发育不同时期的表达情况,以及构建植物表达载体,转化至烟草中,验证该基因在烟草花发育的作用和功能,为进一步研究该基因在麻疯树花发育中的作用及赤霉素影响花发育机制奠定基础。本研究的主要研究结果如下:1.麻疯树JcGAST1基因的c DNA全长克隆本实验以从麻疯树花转录组数据中筛选得到的JcGAST1基因的部分片段为模板,利用RACE PCR技术,设计特异性引物对5′端c DNA和3′端c DNA进行扩增,通过DNAMAN软件对5′端c DNA和3′端c DNA进行拼接,成功得到了JcGAST1基因的c DNA全长。JcGAST1基因全长586 bp,ORF为348 bp,预计编码115个氨基酸。该基因内含一个GASA结构域和信号肽,属于GAST家族。2.JcGAST1基因的原核表达通过构建JcGAST1基因的原核表达载体p ET-30a/JcGAST1,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,利用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测表明,JcGAST1基因表达成功。质谱鉴定结果也表明:JcGAST1基因的表达产物为GAST1蛋白,蛋白分子量为10.746k Da,等电点p I为9.44,共有8条肽段与GAST1蛋白匹配,覆盖率达到74%。此外,JcGAST1蛋白无跨膜结构,且蛋白含有信号肽区域,以及GASA功能结构域;通过对该蛋白理化性质的分析,发现其为稳定蛋白,也是一个亲水性蛋白。同时,通过多重比对分析发现,该蛋白与其他物种中的同源蛋白在C-端有个长为70个氨基酸的保守区域,且在这个保守区域内的C-端的长为60个氨基酸的保守区域内有12个保守半胱氨酸,且其系统发育树分析也发现,麻疯树的亲缘性与橡胶树的最为接近。3.麻疯树花发育不同时期JcGAST1基因的表达分析通过实验室前期的研究,将麻疯树花发育分成了九个关键发育时期,即性别未分化时期、雌花大孢子母细胞时期、雌花大孢子母细胞分裂时期、雌花单核胚囊期、雌花胚囊成熟期、雄花小孢子母细胞时期、雄花四分体时期、雄花单核花粉粒时期、雄花花粉粒成熟期。本实验以麻疯树花性别未分化时期为对照,利用实时荧光定量PCR,分析JcGAST1基因在麻疯树花发育时期的表达情况。结果表明:JcGAST1基因在麻疯树花发育的九个关键时期均表现出显著的差异。在雄花的发育时期中,JcGAST1基因的表达量自小孢子母细胞时期开始显著上升,直至在单核花粉粒时期表达量达到最大,随后在花粉粒成熟期下降;在雌花的发育时期中,大孢子母细胞分裂期的JcGAST1基因的表达量在雌花发育时期中没显著变化,但随后,在单核胚囊期开始下降,直至在胚囊成熟期JcGAST1基因的表达量降至最低。在麻疯树花发育的九个关键时期中,JcGAST1基因在雄花中的表达量高于其在雌花中的表达量,且在雄花四分体和单核花粉粒时期的表达量较高,表明了JcGAST1基因可能参与了麻疯树雄花四分体和单核花粉粒这两个时期的发育。4.花发育不同时期JcGAST1蛋白的表达情况利用Western Blot技术,以JcGAST1蛋白为研究对象,分析其在花发育不同时期的表达情况。结果显示:JcGAST1蛋白在性别未分化时期、雄花四分体时期和雄花单核花粉粒时期的条带比较清晰,尤其是在雄花四分体时期最为明显,表明了JcGAST1蛋白在雄花四分体时期的表达最好,可能参与了雄花四分体的发育。5.JcGAST1基因在烟草中的遗传转化分析以pBWA(V)HS载体为框架构建植物表达载体pBWA(V)HS/JcGAST1,通过农杆菌介导法,将其转化至K326烟草中。对转基因烟草植株的分子检测发现,JcGAST1基因成功的在转基因烟草植株中表达;此外,通过形态学分析,对比野生型烟草K326,转基因烟草的叶片更大(例如叶片更长、更宽)、株型更加紧凑,冠幅更大;此外,转基因烟草花的雄蕊长度比雌蕊长,而在野生型烟草K326里雌蕊比雄蕊长,表明JcGAST1基因不仅参与了雄花的发育,促进花丝的生长,同时还参与了植株的营养生长,尤其是叶片的生长发育。