邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯(DEHP)是一种常见的人造化合物，并广泛存在于塑料制品中。随着现代生活的发展，塑料制品的大量应用，家庭环境中也存在着大量的DEHP，这样大大增加了妇女和儿童接触DEHP的机会。一直以来，DEHP被认为是一种环境内分泌干扰物(EDCs)，对机体可以产生多种不利影响，包括生殖毒性，神经毒性，肝脏毒性等。自上世纪90年代起，就有流行病学调查显示，邻苯二甲酸酯类的大量日常暴露可能是儿童过敏性哮喘等疾病高发的影响因素之一。过敏性哮喘(Allergic Asthma)的发病率一直呈上升态势，其发生的机制是气道上皮细胞在接触到过敏源，或者是病原微生物的抗原刺激后，分泌多种细胞因子参与启动了过敏性哮喘的免疫应答与调控过程，通过抗原提呈细胞(APC)的募集，导致Th2型细胞免疫应答的发生，发生过敏反应。其中，胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)成为研究热点，主要发现其在皮肤和呼吸道黏膜上皮细胞中表达。　　目的:　　本研究拟对孕期及哺乳期大鼠DEHP暴露后，仔鼠OVA致敏激发，以观察DEHP的免疫佐剂效应，并研究其是否通过激发TSLP及其受体启动Th2型细胞免疫应答。　　方法:　　1.1 孕期及哺乳期DEHP暴露动物模型的建立　　健康8周龄雌性Wistar大鼠60只，按体重随机分成三个不同剂量的DEHP暴露组，每组20只雌鼠。适应性喂养一周后，雌鼠与雄鼠1∶1交配，以次晨发现阴栓确定为妊娠0天(gestational day0，GD0)。从GD0起，灌胃不同浓度DEHP(0，30，300mg/kg bw/day)的玉米油分别记为DEHP0组，DEHP30组，DEHP300组。实验期间保持环境清洁，温度适宜，昼夜节律适当，各组母鼠自由摄食饮水，隔天称量体重，根据体重调整灌胃剂量，至仔鼠出生后21天(postnatal day21，PND21)断乳后结束。　　1.2 OVA致敏模型的建立　　仔鼠出生7天后选取不同剂量组雌性仔鼠各10只（从不同窝别中随机选取）共30只记为DEHP0+OVA，DEHP30+OVA，DEHP300+OVA组，分别于出生后第7，14，21天腹腔注射0.5ml致敏液（OVA5mg in saline）致敏，隔天再注射一次，再隔天开始连续三天滴鼻100μL致敏液（OVA100μg in saline）激发;24小时后与母体单纯DEHP暴露组共同取材。　　2.肺泡灌洗液炎性细胞计数　　采集不同时间点不同剂量组的仔鼠肺部灌洗液，1500转4℃离心，10分钟。而后收集细胞，制成细胞悬液后，取10微升悬液，滴于细胞计数板上，开始进行细胞的计数。计数方法即为:细胞数=（四个格子的细胞总数/4）×10000。而后，取400微升的细胞悬液，1500转离心8分钟，室温。弃上清后加入200微升的小牛血清，混匀，在载玻片上推片，晾干，而后，用甲醇固定，于37℃的温箱中过夜，而后用瑞氏吉姆萨染液，染色，室温放置15分钟，采用蒸馏水冲洗背面，晾干后于显微镜下，计数200个细胞中，嗜酸性粒细胞的数量。　　3.病理形态学H&E染色观察肺部炎症状态　　肺组织常规石蜡切片（5μm），进行H&E染色，石蜡切片放入烘箱内烘烤2小时;然后将肺组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟→更换二甲苯后再浸泡10分钟;无水乙醇Ⅰ10分钟→无水乙醇Ⅱ10分钟→95％酒精2～5分钟→85％酒精2～5分钟;苏木精染色液浸染20分钟（新鲜配制的时间短些，使细胞核呈蓝色），自来水一过冲洗，2％盐酸酒精10至15秒;自来水冲洗（可过夜），返蓝;;1％伊红染液浸染1至2分钟，流水冲洗;85％酒精（一过）→95％酒精（一过）→100％酒精10分钟→100％酒精10分钟;二甲苯Ⅰ10分钟透明→二甲苯Ⅱ10分钟，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集观察仔鼠肺组织过敏性哮喘的炎性病理改变。　　4.过碘酸雪夫(PAS)染色观察肺部致敏症状　　石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20分钟→二甲苯Ⅱ20分钟→无水乙醇Ⅰ10分钟→无水乙醇Ⅱ10分钟→95％酒精5分钟→90％酒精5分钟→80％酒精5分钟→70％酒精5分钟→蒸馏水洗。高碘酸氧化:0.5％高碘酸水溶液氧化10分钟。流水冲洗数分钟，蒸馏水换洗两次。雪夫试剂染色:切片入雪夫试剂暗处浸染15～30分钟。流水冲洗10分钟。复染细胞核:苏木素复染核1～2分钟。自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。脱水封片，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集。　　5.酶联免疫吸附试验(ELISA)观察Th2型细胞因子　　分别于PND14、PND21和PND28时，仔鼠乙醚麻醉后心脏采血，断头，取同一侧肺组织200～500毫克，迅速放入EP管中，液氮速冷后，于-80℃冻存。　　将肺组织用预冷的TBS冲洗后加200-300μl含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，超声波细胞粉碎机匀浆，冰上孵育1小时。经13，000g4℃离心10min，取上清至新管中。取上清裂解液用BCA试剂盒测定蛋白浓度，剩余裂解液定浓度为1μg/μl，分装后保存于-80℃，待测。　　应用ELISA试剂盒检测各时间点各组仔鼠肺组织中IL-4、IL-5及IL-13。检测步骤如下:检测之前将所有的试剂，样品平衡至室温。按实际说明稀释各试剂，加入稀释抗体包被过夜，次日弃去孔内溶液，采用洗涤缓冲液洗5次，用力甩干，拍干。每孔中依次加入稀释好的标准品、待测上清各50μl，轻轻晃动混匀，37℃温育1小时;弃去液体，用力甩干，洗涤5次，拍干;每孔加入酶标试剂50μl（空白孔除外），轻轻晃动，37℃温育0.5～1小时;弃去液体，用力甩干，洗涤5次，拍干;每孔分别加入底物液:显色剂A和B各50微升，轻轻地震荡混匀，37℃避光显色10～30分钟。取出酶标板，每孔加入终止液50微升终止反应，以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD)值。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。　　6.Real time-PCR检测Th2型细胞因子及相关通路蛋白mRNA表达量　　取50～100毫克肺组织、胸腺组织，加入1毫升Trizol试剂，冰浴匀浆，12000转离心10分钟，将上清转移至新1.5ml EP管中，室温静置5分钟;每管加入200微升氯仿，用力震荡30秒，室温静置3分钟;12000转，4℃，离心15分钟;吸取上清至新的1.5ml EP管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇0.5毫升，混匀后室温沉淀10分钟;12000转，4℃，离心10分钟后，弃上清;加入4℃预冷的75％乙醇1毫升，洗涤沉淀及离心管壁;7500转，4℃，离心5分钟，弃上清;室温干燥15分钟;加入30μl RNase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度。应用Takara公司逆转录酶，将RNA逆转录成cDNA，再按照Takara公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒配制扩增体系，应用ABI7500Realtime PCR仪定量测定，以-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。　　7.免疫印迹试验(Western Blot，WB)相关通路蛋白表达情况　　分别于PND14、PND21和PND28时，仔鼠乙醚麻醉后心脏采血，断头，取同一侧肺组织500～1000毫克，迅速放入EP管中，液氮速冷后，于-80℃冻存。裂解液裂解后，BCA蛋白测定法调整成统一浓度-80℃保存，用相应的抗体通过Western Blot技术检测TSLP、TSLPR、IL-7R、JAK1/p-JAK1、STAT5/p-STAT5蛋白表达。　　结果:　　1.孕期及哺乳期DEHP暴露促进子代不同时间点OVA致敏后的仔鼠肺泡灌洗液中炎症细胞的聚集　　2.孕期及哺乳期DEHP暴露加重子代不同时间点OVA致敏后的肺部炎症反应　　3.孕期及哺乳期DEHP暴露使子代不同时间点OVA致敏后的仔鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加　　4.孕期及哺乳期DEHP暴露加重不同时间点子代肺组织OVA致敏导致的过敏性哮喘病理改变　　5.孕期及哺乳期DEHP暴露促进不同时间点子代肺组织IL-4的释放　　6.孕期及哺乳期DEHP暴露影响不同时间点子代肺组织IL-5、IL-13的分泌水平　　7.孕期及哺乳期DEHP暴露促进不同时间点子代肺组织中Th2系列细胞因子mRNA的表达　　8.孕期及哺乳期DEHP暴露轻微促进不同时间点子代胸腺组织中Th2系列细胞因子mRNA的表达　　9.孕期及哺乳期DEHP暴露显著诱导不同时间点子代OVA致敏过程中TSLP及其受体的表达及分泌水平　　10.孕期及哺乳期DEHP暴露轻微诱导不同时间点子代OVA致敏过程中JAK1-STAT5信号通路蛋白的表达及分泌水平　　11孕期及哺乳期DEHP暴露显著诱导不同时间点子代OVA致敏过程中核转录因子GATA3，共刺激分子OX40L/OX40的表达　　结论:　　1.孕期及哺乳期DEHP暴露促进子代OVA致敏的病理进程。　　2.孕期及哺乳期DEHP暴露升高Th2型免疫反应进而促进OVA致敏反应的发生发展。　　3.DEHP可通过上调TSLP信号通路升高OVA致敏中Th2型免疫反应。