肛门直肠畸形（anorectal malformations，ARMs）是小儿常见的先天性消化道畸形，发生率约为1/5000～1/1500，病因及胚胎形成机制至今未完全阐明。目前认为，肛门直肠畸形的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，流行病学和动物实验表明，遗传因素在其发病过程中发挥重要作用。　　 近年来关于先天性肛门直肠畸形的重要相关基因研究主要集中在以下三方面:①单纯性ARMs的易感基因研究:国外报道较少，国内学者利用我国病源优势对单纯性肛门直肠畸形的易感基因进行了几项研究，主要集中在Hox基因与ARMs的相关关系研究;②动物模型中ARMs相关基因研究:主要集中在形态发生因子，如Shh/HOX信号通路、EphB2以及Wnt5a/Tcf4等与肛门直肠畸形的相关关系研究。③在总结家族性肛门直肠畸形病例基础上，对肛门直肠畸形的遗传方式进行分析和推测:肛门直肠畸形发病复杂，且常常合并其他畸形，将其分为非综合征型和综合征型，认为非综合征型肛门直肠畸形或合并轻微畸形（如手指、足趾畸形等）的肛门直肠畸形遗传方式可能是多基因遗传;而综合征型肛门直肠畸形，尤其作为某一综合征的一部分出现时，其遗传方式取决于该综合征。因此，对于综合征型肛门直肠畸形家系进行连锁分析，能够将候选基因定位于染色体的特定区带，并进行更详细的定位。　　 本研究从辽宁省某市—先天性肛门直肠畸形合并少见型手足畸形家系入手，前期通过对病史及体格检查发现，该家系连续3代3人均患有畸形程度进行性加重的肛门直肠畸形及手足畸形，并且肢体畸形符合缺指裂掌畸形(split hand-footmalformation，SHFM)。目前手足裂畸形已经定位至5个遗传位点:SHFM1(MIM183600)、SHFM2(MIM313350)、SHFM3(MIM600095)、SHFM4(MIM605289)和SHFM5(MIM606708)，分别位于人类染色体7q21、Xq26、10q24、3q27和2q31，候选基因包括DLX5/DLX6，DAC，P63，HOXD13，故我们特定设计候选基因外显子引物序列，采用直接基因测序的方法将患者的扩增片段DNA序列分别与该家系表型正常成员和正常对照组以及人类基因库DNA序列进行比较时，发现P63基因外显子发生杂合性突变;应用4-10周人胚标本，通过免疫组织化学染色连续动态观察肛门直肠形成过程中致病基因的表达、分布规律，分析其在肛门直肠胚胎发育过程中的时空分布规律，初步探讨该致病基因在肛门直肠胚胎发育中的作用;同时，应用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)诱导Wistar大鼠胚胎产生肛门直肠畸形动物模型，结合免疫组织化学、实时定量PCR和蛋白免疫印记研究分析P63蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律，探讨P63在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中所发挥的作用，分析P63与肛门直肠畸形胚胎发生机制的关系;此外，本研究应用体外实验，构建野生型和突变型真核表达载体，通过Westernblot检测P63R227Q二聚体形成和分泌功能的改变，初步分析P63致病基因突变与肛门直肠畸形的关系，为解决人类先天性肛门直肠畸形的产前诊断、畸形预防和发现新的治疗手段提供可靠线索。　　 材料和方法：　　 一、实验材料　　 1、家系成员和血样标本　　 辽宁省某市1个先天性肛门直肠畸形合并手足畸形家系:先证者Ⅳ1是家族中出现的第3位患者，此家系中共出现3名患者，对该家系中3例患者及部分正常个体做全面的体格检查，征得患者同意后，在无菌条件下分两次采集先证者及其家庭成员(Ⅱ1,2，Ⅲ1-4，Ⅲ3，4，Ⅳ1，2)的外周静脉血各5mL，并采集其他100名正常人的外周静脉血作为正常对照组。　　 2、人类胚胎标本　　 收集因意外原因造成人工流产，发育正常的人胚胎标本51例（每例标本均得到产妇本人同意）。根据产妇末次月经时间、B超所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄4～10周。　　 3、实验动物　　 体重250～300克的Wistar大白鼠，由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。　　 4、实验试剂　　 ①P63多克隆抗体（购自美国SantaCruz公司）;②TaqDNA聚合酶及其反应缓冲体系(TaKaRa公司)③免疫组化UltrasensitiveTMSp超敏试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司）;二步法山羊免疫组化检测试剂盒（购自北京中杉金桥公司）;④乙烯硫脲(Ethylenethiourea，ETU)(购自德国Sigma-Aldrich公司);⑤逆转录试剂盒（购自大连宝生生物工程有限公司）;⑥总蛋白抽提试剂盒（购自赛驰公司）;⑦质粒小量提取试剂盒（Qiagen公司）。　　 二、实验方法　　 1、肛门直肠畸形家系体格检查和致病突变基因鉴定　　 所有研究对象均经其家属知情同意后，采用EDTA抗凝外周静脉全血2ml，用苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，进行候选基因外显子PCR扩增，PCR产物进行测序分析。　　 2、P63在人类胚胎正常后肠及肛门直肠表达的研究　　 4-5周胚胎取整个胚胎，5-8周及8周以上胚胎取其盆部，标本经0.01M PBS液冲洗后立即至于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定12小时～24小时，常规脱水、石蜡包埋。石蜡标本进行矢状面连续切片，厚度4μm，在显微镜下观察未染色切片，在观察泄殖腔或直肠膀胱出现时连续保留切片10～20张，连续的3张切片，分别进行HE和免疫组化染色，免疫组化实验采用SP法。　　 3、肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育中P63表达时空性研究　　 成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10)，按125mg/kg经胃管注入ETU（浓度为1％，以生理盐水做溶剂），制作ARMs大鼠动物模型;对照组给予等量的生理盐水。分别在大鼠E14-E16时剖宫取胎，经4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定、脱水后制成蜡块，行矢状面、横断面的连续切片，分别进行如下实验: P63免疫组化染色连续动态观察P63在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达;常规制备胎鼠冰冻切片，解剖显微镜下手工显微分割方法准确切取泄殖腔标本，从中提取总RNA和总蛋白，通过qRT-PCR和Western blot方法研究P63mRNA和蛋白在正常以及畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达。所有数据差异比较采用SPSS13.0软件进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。　　 4、P63基因突变功能初步分析　　 (1)构建野生型和突变型真核表达载体:PCR扩增目的基因TAP63编码序列，分别与真核表达载体pLXSN和p3xFLAG-CMV7连接后转化感受态细胞，阳性克隆测序验证;以野生型载体为模板，定点诱变产生突变型载体。　　 (2)Western blot检测TAP63R227Q二聚体形成和分泌:G418筛选稳定整合野生型和突变型TAP63的COS7细胞系，收集细胞培养上清和细胞总蛋白，经非还原SDS-PAGE电泳后检测TAP63R227Q二聚体形成和分泌情况。　　 结果：　　 1、肛门直肠畸形家系表型及致病基因鉴定　　 该家系患者祖孙三代均患有畸形程度进行性加重的肛门直肠畸形及手足畸形，其中2例肢体畸形符合缺指裂掌畸形;病因研究提示，将患者扩增的片段DNA序列分别与正常对照组以及人类基因库DNA序列进行比较，发现位于P63基因第6外显子的第797位碱基对发生突变，即由G突变为A，密码子CGA-＞CAA，该突变结果为错义突变，导致相对应的第227位氨基酸由精氨酸-＞谷氨酰胺。　　 2、P63基因在人类胚胎肛门直肠的时空表达　　 胚胎第4周，胚胎尾端尿直肠隔向泄殖腔内伸展，突出，形成一个类似U型的结构，将泄殖腔分隔成腹侧的尿生殖窦和背侧的后肠。P63特异的大量表达于尿直肠隔和尿生殖窦顶端上皮、后肠及泄殖腔膜。　　 胚胎第6周，泄殖腔管变窄，但是泄殖腔隔和泄殖腔膜尚未融合。泄殖腔隔上皮和后肠远端、泄殖腔膜持续强阳性表达P63。尤为明显的是，泄殖腔膜变薄、延长，但P63在此仍然阳性表达，直到泄殖腔膜破裂。　　 胚胎第8周，肛门直肠形成，直肠腔内含有大量细胞栓子，此时P63在肛管及尿道黏膜上皮阳性表达，而直肠黏膜上皮无表达。　　 胚胎第10周，直肠腔内细胞栓子逐渐消失，P63在齿状线远端肛管上皮持续表达，而近端无表达。　　 3、肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中P63表达时空性研究　　 (1)P63在大鼠胚胎发育过程泄殖腔中的表达:正常大鼠第13天时，大量的P63阳性细胞分布于尿直肠隔、后肠和泄殖腔膜的上皮层;第14天时，阳性细胞主要出现在尿直肠隔与泄殖腔膜的接近融合区域，同时，后肠的末段和尿道组织内也可见大量的阳性细胞;第15天，尿直肠隔与泄殖腔膜的融合区域的上皮内可见大量的阳性细胞;菲薄的肛膜上也出现免疫反应强的阳性细胞，并且免疫反应的强度几乎达到顶峰;第16天，肛膜破裂，肛门直肠形成，P63在肛管黏膜层表达及外层表皮中表达，但在直肠远端不表达。P63在肛门直肠畸形胎鼠泄殖腔和直肠粘膜表达较弱或呈阴性表达。　　 (2)Western blot和qRT-PCR定量检测结果:在发育期的后肠中P63蛋白和P63mRNA的表达表现出时间依赖性的特点，在肛门形成的关键时期，即14天和15天时P63的表达水平达到高峰，一旦肛门形成其表达量随即开始降低，畸形组与正常组比较，P63蛋白和P63 mRNA的表达在14～15天明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05）。　　 4、TAP63R227Q基因二聚体形成和分泌　　 测序结果表明野生型和突变型P63真核表达载体(pLmycTAP63WTSN和pLmycTAP63R227QSN)构建成功，无突变，阅读框正确。Westernblot检测结果表明P63R227Q突变体可以二聚化并分泌至细胞外，二者表达无明显差异。　　 结论：　　 1、肛门直肠畸形合并缺指裂掌畸形可能是一种新的综合征表现型;致病基因突变为P63第6外显子的第797位碱基对发生突变，即由G突变为A，密码子CGA-＞CAA，为错义突变，导致相对应的第227位氨基酸由精氨酸-＞谷氨酰胺。　　 2、P63在人类肛门直肠中存在表达，并存在时空表达不均衡性的特点;　　 3、肛门直肠畸形大鼠胚胎后肠发育过程中，P63存在表达，其表达的减弱可能引起肛门直肠畸形的发生;　　 4、TAP63R227Q突变体可以二聚化并分泌至细胞外，与野生型无显著差异。