第一部分不同抑菌浓度苦参碱对大肠埃希菌外膜蛋白A表达量的影响目的:本实验采用LB肉汤—腹膜透析外接硅胶管系统建立大肠埃希菌体外细菌生物膜模型,探讨在大肠埃希菌生物膜早、中、晚期,不同抑菌浓度的苦参碱对大肠埃希菌外膜蛋白A (ompA)表达量的影响。方法:用二倍稀释法分别测量苦参碱和左氧氟沙星对大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC)。将经过高压蒸汽灭菌的腹膜透析管载体置入无菌的24孔板中,随机分为6组:空白对照组(阴性对照组)、1/2MIC左氧氟沙星组(阳性对照组)、1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组、1/8MIC苦参碱组、1/16MIC苦参碱组。从开始建立大肠埃希菌生物膜模型时,就将药物加入药物干预组调成相应的药物浓度。于生物膜早(1天)、中(3天)、晚(7天)期,分别利用细菌蛋白抽提试剂提取24孔板中细菌总蛋白,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测不同时间、不同药物及浓度下大肠埃希菌外膜蛋白A (ompA)的表达量。结果:在不同药物抑菌浓度的干预下,1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组、1/8MIC苦参碱组、1/16MIC苦参碱组及1/2MIC左氧氟沙星组与空白对照组相比较,无论在生物膜早(1天)、中(3天)、晚(7天)期,大肠埃希菌外膜蛋白A (ompA)的表达量均减少(P<0.05),且不同浓度苦参碱组之间对ompA蛋白表达量的影响统计学无明显差异(P>0.05)。结论:1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组、1/8MIC苦参碱组、1/16MIC苦参碱组及1/2MIC左氧氟沙星组在大肠埃希菌生物膜早、中、晚期均能抑制其外膜蛋白A (ompA)的表达。第二部分 大肠埃希菌OmpA蛋白原核表达载体的构建目的:对大肠埃希菌的外膜蛋白A基因(ompA)进行克隆,鉴定,构建原核基因表达载体,为构建OmpA过表达菌株奠定基础。方法:以大肠埃希菌K12菌株基因组DNA为模板,用PCR法扩增基因ompA,接着用酶切、连接、转化等系列方法,将此基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质粒ompA-pET-32a,并通过PCR进行验证,将初步验证正确的重组质粒进行测序鉴定。将鉴定正确的重组体转化入表达宿主E coli Rosetta菌株内,为后续对转化菌株Rosetta以IPTG进行诱导做准备。结果:经PCR鉴定、DNA测序验证构建的重组质粒,证实ompA基因正确地插入到pET-32a(+)中,得到重组表达质粒ompA-pET-32a;测序结果显示,ompA为完整的编码区基因1041bp,蛋白相对分子质量约为36kDa。结论:成功构建了含有OmpA蛋白编码基因的重组原核表达质粒,获得阳性重组质粒的Rosetta宿主菌,为进一步构建OmpA过表达菌株奠定了基础。