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【目的】乙型肝炎病毒(HBV)是一种包膜的DNA病毒,包括较少的完整病毒颗粒以及大量缺少核心蛋白的亚病毒颗粒。HBV基因组是部分双链DNA,基因组3.2 kb,编码产生四个转录本,即3.5 kb mRNA,2.4 kb mRNA,2.1 kb mRNA以及0.7 kb mRNA。有四个重叠的开放阅读框(ORF):S、P、C、X,分别编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)、DNA聚合酶(HBV DNA pol)、核心蛋白(HBc Ag和HBe Ag),以及X蛋白(HBx)。micro RNA(miRNA)是一类长约22 nt的单链非编码RNA,主要通过调控与之互补的靶基因的表达发挥其生物学功能。越来越多的人和动物的病毒被确定编码miRNA,病毒miRNA可影响宿主功能以及体内一些病毒感染的自然进程。然而HBV是否编码miRNA缺乏实验依据以及HBV编码的非编码RNA是否影响其在感染过程中的自我复制仍然是一个值得研究的问题。前期研究中我们利用深度测序在HBV阳性的肝癌组织中获得了HBV编码的小非编码RNA。本课题着重探究HBV编码的HBV-miR-3对HBV复制的作用以及其机制研究。【方法】首先我们通过生物信息学网站预测了HBV-miR-3的二级结构,分析其在HBV不同基因型中的保守性。通过Northern blot及RT-q PCR实验验证其存在。通过RT-q PCR实验验证HBV-miR-3由HBV哪个转录本编码,检测HBV阳性及阴性肝癌组织,HBV阳性及阴性肝细胞系及非肝细胞系,HBV感染病人血清中HBV-miR-3的表达情况。通过Western blot实验检测HBV-miR-3的生成是否是经典的miRNA生成过程,RNA免疫共沉淀实验研究HBV-miR-3在RISC-Ago2复合物中的表达情况,蔗糖密度梯度离心实验及RNA免疫共沉淀实验研究HBV-miR-3是通过何种方式分泌到细胞胞外。同时,我们通过ELISA实验研究HBV-miR-3对HBs Ag,HBe Ag分泌的影响,RT-q PCR实验研究HBV-miR-3对上清HBV DNA水平、HBV完整病毒颗粒,HBV前基因组RNA、总RNA水平的影响,Southern blot实验检测HBV-miR-3对HBV复制中间体的影响,再次我们通过生物信息学的方法预测,并通过Western blot、RT-q PCR以及EGFP荧光报告载体实验验证HBV-miR-3的靶基因,并进一步研究了靶基因的功能。最后我们通过双荧光素酶实验研究HBV-miR-3及靶基因对HBV启动子的影响。【结果】Northern blot及RT-q PCR实验确证HBV编码HBV-miR-3,HBV-miR-3来自乙肝病毒三个转录本3.5 kb mRNA,2.4 kb mRNA,2.1 kb mRNA。HBV-miR-3存在于HBV阳性的肝癌组织及细胞系中,HBV急性感染病人血清中HBV-miR-3的表达量较恢复期的高。HBV-miR-3的生成是依赖Drosha,Dicer的经典的miRNA生成途径,存在于RISC-Ago2复合物中,通过外泌体和完整病毒颗粒的方式分泌到细胞外。HBV-miR-3抑制HBs Ag,HBe Ag分泌,上清HBV DNA水平,完整病毒体的分泌,HBV复制中间体,HBV前基因组RNA及总RNA的表达。HBV-miR-3靶定HBV 3.5 kb转录本,抑制HBV核心蛋白的表达,但不影响HBV DNA聚合酶的表达。HBV-miR-3通过靶定宿主因子STAT3抑制HBV Enh I/Xp的活性。【结论】HBV编码miRNA,即HBV-miR-3。HBV-miR-3通过两个途径抑制HBV复制,一种途径是通过靶定下调HBV 3.5 kb转录本,抑制HBc蛋白的产生,另一种途径是通过靶定并下调宿主因子STAT3抑制HBV Enh I/Xp启动子活性,进而抑制HBV复制转录。