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背景与目的：缺血性脑卒中是世界范围内引起死亡和瘫痪的主要病因，并给家庭和社会造成沉重的经济和社会负担。目前仍缺乏有效的治疗药物帮助脑卒中患者恢复受损的神经功能。成年动物大脑损伤后脑组织神经可塑性有限，脑卒中患者常遗留有明显的神经功能障碍。促进大脑神经可塑性是促进缺血性脑损伤后神经功能恢复的重要途径。近年来多项研究发现生长抑制与DNA损伤修复基因b (growtharrest and DNA-damage inducible gene b, Gadd45b)可能为影响神经可塑性相关基因，Gadd45b极有可能成为具有治疗潜力的分子指标。本研究探讨调控内源性Gadd45b表达对实验性缺血性卒中后轴突可塑性和运动功能恢复的影响及其信号调控通路，同时研究小脑顶核电刺激对脑梗死后内源性Gadd45b表达及其神经功能恢复的影响，为脑梗死后神经功能康复病理生理机制的了解和临床干预提供理论基础。方法：第一部分：构建针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体，并检测该RNA干扰载体的转染效率和干扰效率。将高、中、低三种不同滴度(剂量)的慢病毒载体和阴性对照病毒载体立体定向至大鼠脑组织。采用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein, GFP)的表达；采用荧光定量PCR (Q-PCR)检测三种不同滴度慢病毒载体对大鼠脑组织Gadd45b mRNA的抑制效率。通过以上检测筛选出慢病毒载体的最佳转染滴度。第二部分：采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠实验性缺血性卒中模型。通过立体定向脑内注射生物素葡聚糖胺(biotinylated dextranamine, BDA)追踪MCAO大鼠皮质红核束(corticorubral tract, CRT)的新生神经轴突出芽。通过检测生长相关蛋白43(Growth associatedprotein-43, GAP43)表达变化反映脑缺血后轴突再生。采用“楼梯测试”和“平衡木实验”评价大鼠脑缺血后瘫痪前肢运动功能。我们采用RNA干扰技术抑制内源性Gadd45b表达研究其对MCAO模型大鼠轴突可塑性和运动功能恢复的影响。第三部分：采用MCAO建立成年大鼠实验性缺血性卒中模型。采用RNA干扰抑制大鼠脑内Gadd45b内源性表达。通过免疫组化、Q-PCR和Western Blot分别检测脑缺血后2天和14天脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的免疫反应、mRNA和蛋白表达水平。通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫组化和Western Blot检测大鼠脑缺血后2天和14天缺血侧脑组织cAMP/PKA/pCREB信号通路表达水平。采用Q-PCR和Western Blot分别检测脑缺血后2天和14天ROCK mRNA和蛋白表达水平。藉此探讨Gadd45b调控轴突可塑性的信号调控通路。第四部分：采用MCAO建立成年SD大鼠实验性缺血性卒中模型。脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)后立即给予1小时小脑顶核电刺激(fastigial nucleus electrostimulation, FNS)研究其对大鼠脑缺血后Gadd45b表达和神经功能恢复的影响。采用免疫组化、Q-PCR和Western blot检测Gadd45b表达水平。藉此研究小脑顶核电刺激对脑梗死后Gadd45b表达变化的影响，探讨小脑顶核电刺激应用于临床促进脑梗死后功能康复的分子机制。结果：第一部分：成功构建出针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体。激光共聚焦结果显示，高、中、低三种不同剂量组大鼠皮层和海马组织注射点周围均出现GFP阳性表达。高滴度和中滴度组GFP阳性表达高而低滴度组GFP阳性表达较低。Q-PCR结果显示，与正常对照组相比，高滴度和中滴度组Gadd45b mRNA表达下降超过70%(P<0.05),高滴度和中滴度组之无明显差异(P>0.05)，低滴度组与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。第二部分：免疫荧光结果显示，与假手术组(sham)相比，脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组(LV-Control)与缺血组(MCAO)相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组(LV-shGadd45b)大鼠GAP43阳性细胞数则明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠GAP43mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。BDA神经示踪结果显示，与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠脑缺血后皮质红核束代偿性的新生轴突明显下降(P<0.05)。与单纯缺血组相比，Gadd45b-RNAi干预处理明显抑制大鼠脑缺血后的运动功能恢复(P<0.05)。第三部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d及14d缺血侧皮质BDNF阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠BDNF阳性细胞数明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质BDNF mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠BDNF mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。免疫组化结果显示，与假手术组相比，脑缺血后2d及14d缺血侧皮质PKA和pCREB阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠PKA和pCREB阳性细胞数均明显下降(P<0.05)。 ELISA结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质cAMP和PKA蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠cAMP和PKA蛋白水平明显下降(P<0.05)。Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质pCREB蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠pCREB蛋白水平明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质ROCK mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠ROCK mRNA和蛋白水平进一步明显增加(P<0.05)。第四部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数在缺血后6h至3d均表达升高(P<0.05)，缺血组和假刺激组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数进一步增加(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠Gadd45b mRNA和蛋白水平在脑缺血再灌注后6h开始增加，24h达高峰，3d下降到比较低的水平但仍高于假手术组(P<0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠Gadd45bmRNA和蛋白水平在脑缺血后各时间点进一步明显增加(P<0.05)。此外，与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠脑缺血损伤后神经功能评分显著下降(P<0.05)。结论：慢病毒载体能高效地转染大鼠脑组织，有效地进行大鼠Gadd45b特异性shRNA基因转导。Gadd45b-RNAi有效抑制了大鼠脑组织内源性Gadd45b表达。Gadd45b-RNAi干预处理同时还抑制cAMP/PKA/pCREB信号通路激活并促进ROCK表达。因此，Gadd45b可通过调控BDNF-cAMP/PKA-CREB信号通路激活抑制ROCK通路，从而对脑缺血后的轴突可塑性发挥作用。脑缺血后电刺激小脑顶核可能是通过激活Gadd45b促进功能恢复。