[目的与背景]全球丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus, HCV)的感染人数约为1.85亿,占总人数的3%,而且每年新增感染人数还在迅速增长,发展中国家HCV感染尤为严重,东亚地区高达3.7%。大约有20%左右的HCV感染者可以自愈,但是绝大多数(70%-80%)则会发展成为慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC),如果不及时进行治疗,CHC患者中有四分之一将逐渐发展为肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝癌(primary liver cancer, PLC)。因此HCV感染严重威胁着人民的生活质量和身体健康。由于标准抗病毒方案副反应大、病毒应答率低,因此寻找新的直接抗病毒药物成为研究的热点。HCV非结构蛋白5B (non-structural protein 5B,NS5B)是一个相对分子量为68kDa的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRp),在HCV复制过程中发挥关键作用,缺少了NS5B RdRp, HCV基因就不能从单链RNA合成双链RNA。NS5B蛋白又称为尾锚定蛋白,其C端是由21个氨基酸组成的高度疏水区域构成的α-螺旋结构,参与复制复合物在感染细胞的内质网上的组装过程,N端构成HCV NS5B的催化活性中心。NS5B RdRp不但在HCV复制过程中发挥关键作用,还参与调解HCV的解旋酶活性。同时由于宿主细胞中不表达与NS5BRdRp功能类似的酶,针对NS5B RdRp的抑制剂选择性非常强。因此,从NS5B RNA聚合酶着手,研究抗HCV的药物具有广阔的前景。虚拟筛选(virtual screening)最早是指根据靶标的活性位点或已知的活性化合物的结构特征,从化合物库中挑选活性分子的药物设计方法。随着虚拟筛选技术的不断完善及发展,虚拟筛选的范围也不断扩大。现在,虚拟筛选除了上述内容外,还包括应用特定的技术筛选具有特定性质的靶标。因此,随着虚拟筛选技术越来越快的发展,新药的研发将得到极大的推动。分子对接(molecular docking)是药物设计的方法之一,主要研究配体与受体间的相互作用,预测它们结合力的强弱以及结合模式。进行分子对接时配体和受体之间要满足空间结构以及能量的匹配,自由能是受体和配体结合过程中一个非常重要的概念。它从整体出发,研究配体和受体结合的效果,也是研究蛋白质分子间互相作用的一种有效手段,有利于先导化合物的研发。目前在抗肿瘤药物研究领域,分子对接技术已经得到越来越广泛的应用。分子模拟软件能够预测配基与受体之间的亲和力,提高命中合成物的几率,降低实验成本,缩短研发周期,因此越来越到受人们的青睐。借助计算机分子模拟技术,充分发挥天然蛋白质分子的特异性和合成配基的稳定性,进而筛选出高亲和性的配基,这是进行药物筛选的一个非常有发展前途的新思路。本试验设计了一系列不同长度的多肽组合库,利用分子对接软件,将多肽与HCV NS5B RNA聚合酶上特定的抑制性位点进行分子对接,通过软件评分系统对对接结果进行评定,并对结果进行综合分析,以期筛选出具有抑制HCV NS5BRNA聚合酶活性的多肽,为进一步研发抗HCV药物奠定基础。第一部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制多肽虚拟筛选1目的借助虚拟筛选技术,利用分子对接软件对NS5B RNA聚合酶的多肽抑制剂进行初步虚拟设计。2方法利用分子对接软件SYBYL-X2.0来完成。设计包含NS5B RNA聚合酶催化活性关键氨基酸位点的活性口袋。采用逐个氨基酸延长的方法,设计能够与HCV NS5BRNA聚合酶最佳结合的多肽序列。利用SYBYL/MOLCAD模块自动生成NS5B RNA聚合酶／多肽的溶剂表面,计算此表面上的范德华力、静电相互作用、氢键结合性和疏水性。3结果(1)筛选出12条能够与HCV NS5B RNA聚合酶最佳结合的多肽序列,所设计的活性口袋完全涵盖了HCV NS5B聚合酶Thumb区的关键活性位点。(2)范德华力是一种非常重要的作用力；Asp220、Thr221、Asn291、Asp318、 Asp319、Gly317等区域的静电作用都比较强,多肽与HCV NS5B结合时形成一定的静电相互作用；氢键在配基与目标蛋白之间的亲和力中作用巨大。4结论筛选出的12条氨基酸序列均能与HCV NS5B RNA聚合酶结合。第二部分HCV NS5B RNA聚合酶的体外表达和纯化1目的构建HCV NS5B全长蛋白(NF)、C端21个氨基酸缺失蛋白(N-21)和C端51个氨基酸缺失蛋白(N-51)三种表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。2方法采用基因工程手段,对目的基因进行扩增,构建表达载体；将建立成功的三种质粒分别进行PCR扩增,然后用BamH I和Xho I进行酶切鉴定；对目的蛋白的表达体系进行系统优化及镍柱纯化。3结果(1)三种质粒和目的片段大小与预期大小一致,说明所构建质粒符合要求。(2)酶切质粒大小为5360bp,目的片段大小分别为1773bp、1720bp和1620bp。当IPTG的浓度为1.1mmM、诱导3h时,目的蛋白的表达效果最佳。(3)表达蛋白经过镍柱纯化可以明显提高目的蛋白的纯度。4结论成功构建符合实验要求的表达载体,三种长度的HCV NS5B表达蛋白均可正常表达。第三部分HCV NS5B RNA聚合酶表达蛋白体外活性鉴定1目的鉴定表达蛋白的活性。2方法将表达蛋白进行Western-Blot分析,构建表达NS5B蛋白与多肽结合的ELISA体系。建立NS5B蛋白体外活性鉴定体系,对NS5B聚合酶的浓度和反应时间等条件进行优化。3结果(1)3个蛋白经过诱导表达后与HCV感染阳性血清均能反应,在55-70KDa处有一条清晰的反应条带。(2)设计的多肽均能与表达蛋白结合,N-21表达融合蛋白测定结果和虚拟对接结果之间有一定的相关性。(3)建立NS5B蛋白体外活性鉴定体系时,当反应体系中加入10μI浓度为10μg/ml的NS5B蛋白、反应时间为30min时,表达的NS5B RNA聚合酶活性最佳。(4)3种NS5B表达蛋白的聚合酶活性Km值：NF为5.0μM、N-21为2.9μ M、N-51为2.5 μ M。4结论本研究表达的不同长度HCV NS5B融合蛋白均有正常的NS5B蛋白活性和聚合酶活性,其Km值也完全满足后续实验要求。第四部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽的筛选与鉴定1目的对HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽进行筛选与鉴定。2方法利用本研究建立的HCV NS5B RNA聚合酶体外活性鉴定体系进行多肽抑制筛选。3结果筛选的12条多肽中,P72和P84对3种蛋白的聚合酶活性均有显著抑制作用,P72的IC50为9.85μ M,P84的IC50为13.57μ M。4结论通过虚拟筛选得到的HCV RNA聚合酶抑制性多肽能够抑制NS5B蛋白的生物学活性。