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背景与目的脂多糖(LPS)又称为内毒素,在革兰氏阴性细菌外壁的构成中占主要成分,是急性肺损伤(ALI)主要致病因素之一。脂多糖结合蛋白(LBP)作为LPS的结合蛋白,可以将LPS递呈给位于单核巨噬细胞及中性粒细胞表面的受体CD14。该过程将启动炎症信号通路,使炎症反应被级联式放大,导致机体一系列病理反应的发生。LBP/CD14系统位于LPS炎症信号通路的上游,可以增敏LPS介导的炎症反应。LBP不但可以将LPS递呈给CD14触发炎症效应,还可以将LPS传递给高密度脂蛋白,通过肝脏将LPS从体内清除。阻断LBP与CD14的结合,不仅抑制了LPS介导的炎症级联反应,还不会影响LBP对LPS的清除作用。所以寻找LBP/CD14的结合位点并封闭该位点,将成为我们治疗内毒素性ALI的新途径。我们前期的研究中,通过对噬菌体展示十二肽库的筛选,获得一条模拟肽MP12,经genbank分析为LBP/CD14结合位点的模拟肽。该模拟肽定位在LBP的C端,实验证实该模拟肽具有体内外的抗内毒素效应,但其工作浓度较高,活性还有待提高。本研究采用易错PCR(ep-PCR)和噬菌体展示技术对该模拟肽进行体外定向进化,以提高其体内、外的抗内毒素活性。方法1.利用ep-PCR突变技术对LBP的C端进行扩增,连接PCR产物和T7噬菌体,组成突变体噬菌体展示文库。通过亲和淘选及竞争抑制两种特异性的筛选方式,定向筛选出能与LBP竞争与CD14结合的阳性克隆。经DNA测序并合成阳性克隆所含的多肽(命名为P1),并与前期实验获得的LBP/CD14结合位点的模拟肽(MP12)进行体内、外抗内毒素活性的比较。2.培养U937细胞,采用RT-PCR和ELISA方法比较相同浓度的P1和MP12对LPS诱导的U937细胞肿瘤坏死因子-a(TNF-?)mRNA表达和TNF-?生成的影响;采用EMSA方法比较两条多肽对核转录因子(NF-?B)活化的影响。3.通过颈静脉注射LPS致伤Wistar大鼠复制ALI模型,观察P1和MP12对ALI大鼠氧分压(Pa O2)、氧合指数(PaO2/Fi O2)、肺组织病理、肺微血管通透性(PMVP)及死亡情况的影响。结果1.经ep-pcr突变的扩增片段和t7噬菌体连接后,通过4轮对突变体文库的定向筛选,目标噬菌体得到有效富集,最终筛选出11个阳性克隆。经dna测序后发现其中9个阳性克隆在lbp第287位氨基酸发生由苏氨酸(t)到甲硫氨酸(m)的转变(突变率为81.8%)。人工合成一条从lbp第252到291位氨基酸的多肽,命名p1,其中第287位氨基酸由原来的t替换为m,为了比较p1与前期研究筛选得到的多肽mp12的抗内毒素效应,合成一条长度仍为lbp的第252到291位氨基酸的多肽,其第252到263位氨基酸由mp12替代。2.u937细胞经lps诱导后出现tnf-?mrna表达、tnf-?生成和nf-?b的活化(与对照组相比,p<0.01);加入lbp后lps/lbp复合物使tnf-?mrna表达、tnf-?生成和nf-?b活化的水平显著增加;分别加入多肽p1和mp12后,lps诱导的u937细胞tnf-?mrna表达、tnf-?生成和nf-?b的活性显著被抑制(p<0.01),p1对tnf-?mrna表达和nf-?b的活性的抑制作用高于mp12(p<0.05),对tnf-?生成的抑制作用显著高于mp12(p<0.01)。3.与对照组比较,lps致伤大鼠后pao2、pao2/fio2明显降低(p<0.01),肺组织病理评分和pmvp均较对照组增加(p<0.01);多肽p1和mp12可以明显改善上述指标(与lps组比较,p<0.01);经p1治疗后lps所致内毒素性ali大鼠的pao2、pao2/fio高于mp12治疗组(p<0.05),肺组织病理评分较mp12组低(p<0.05),pmvp也较mp12组低(p<0.01)。结论1.本研究通过ep-pcr扩增lbp的c端序列并连接噬菌体,成功实现对lbp的c端的定向进化,筛选出能够与lbp竞争结合cd14的阳性克隆,经测序发现突变频率最高的位点位于lbp第287位氨基酸,由原来的苏氨酸(t)突变为甲硫氨酸(m),根据突变位点的氨基酸序列,合成含该位点的多肽p1,序列为:fhrnhrspvtllaavmslpeehnkmvyfaisdyvfnmasl。并合成含有前期实验获得的mp12序列的多肽,命名为mp12,其氨基酸序列为:fhrwptwplpspaavmslpeehnkmvyfaisdyvfntasl。2.多肽p1和mp12均能抑制lps诱导的u937细胞的tnf-?mrna表达、tnf-?生成和nf-?b活化,p1的抑制作用强于mp12。3.多肽p1和mp12均能改善lps致伤的ali大鼠的氧合情况,减轻大鼠的肺组织损伤,改善pmvp;lps致伤大鼠经两条多肽治疗后,p1对ali大鼠肺组织的保护作用优于MP12。4.P1可能通过抑制LBP/CD14结合而发挥抗内毒素作用,该多肽在体内、外具有更高的抗内毒素活性,提示LBP的C端第287位氨基酸可能对LBP与CD14的结合具有重要意义。