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在人体不同类型细胞中,红细胞是机体血液循环系统中数量最多的有形成分,红细胞膜富含脂质和蛋白质,红细胞的完整性是保证机体正常生理功能的结构基础。研究表明,过量的氧自由基氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸,产生具有很强生物毒性的羰基化合物,而羰基化合物极易与细胞膜磷脂、蛋白质等发生羰-氨交联反应,造成细胞膜结构的破坏和生理功能的丧失,最终导致细胞凋亡和老化死亡,这一过程是机体衰老损伤的核心过程,甚至是机体衰老改变的生化本质。现代药理研究表明,许多中草药有效成分具有对红细胞的保护作用,其中以黄酮类研究最为广泛,黄酮类化合物对红细胞保护作用机制主要是通过提高抗氧化酶活性,保护红细胞形态以及细胞膜骨架结构功能来实现的。荭草苷在金莲花总黄酮中含量较高,属于黄酮碳苷类。其结构为3’,4’,5,7-四羟基黄酮-8-D-毗喃葡萄糖苷。研究表明,荭草苷具有体外清除氧自由基作用,对D-半乳糖致衰老小鼠海马区神经细胞结构的功能以及对缺血性心肌细胞损伤具有保护作用。荭草苷对红细胞氧化损伤以及自然老化的保护作用研究尚未见报道。本研究建立体外红细胞氧化损伤模型及红细胞自然衰老模型,以维生素C为阳性对照,研究比较荭草苷及其苷元木犀草素对人红细胞的保护作用机制,确立药物构效关系。建立H202诱导红细胞脂质过氧化损伤模型。实验分正常组、模型组、荭草苷预保护组(10,20,40μg·mL-1)、木犀草素预保护组(10,20,40μg·mL-1)、维生素C对照组(20μg·mL-1。检测各组红细胞溶血率、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、Na+-K+-ATPs、Ca2+-Mg2+-ATPs, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析膜蛋白,扫描电镜(Scanning electron microscopy, SEM)观察红细胞表面形态,透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察红细胞膜骨架结构。建立红细胞自然老化模型,红细胞37℃孵育48h。实验分正常组、模型组、荭草苷预保护组(10,20,40μg·mL-1)、木犀草素预保护组(10,20,40μg·mL-1)、维生素C对照组(20μg-mL-1。检测各组红细胞溶血率、MDA、SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATPs、Ca2+-Mg2+-ATPs、唾液酸(Sialic acid,SA), SDS-PAGE分析膜蛋白,SEM观察红细胞表面形态变化,TEM观察红细胞膜骨架结构。结果表明：1荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞溶血率的影响H202诱导红细胞氧化损伤,模型组溶血率增大,与正常组相比有显著性差异(P<0.01)；荭草苷、木犀草素、维生素C均可不同程度抑制红细胞溶血,与模型组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01),且与浓度呈正相关；与木犀草素相比,荭草苷10,20μg·mL-1浓度组红细胞溶血率高于木犀草素同浓度组,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组相比无显著性差异；与维生素C相比,荭草苷与木犀草素10,20μg·mL-1浓度组红细胞溶血率高于维生素C20μg·mL-1浓度组,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组与维生素C相比无显著性差异；红细胞37℃孵育48h后,模型组红细胞溶血率升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01)；荭草苷、木犀草素、维生素C均可不同程度抑制红细胞溶血,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；与木犀草素相比,荭草苷10,20μg·mL-1浓度组红细胞溶血率高于木犀草素同浓度组,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组相比无显著性差异；与维生素C相比,荭草苷与木犀草素10,20μg·mL-1浓度组红细胞溶血率高于维生素C20μg·mL-1浓度组组,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组与维生素C组相比无显著性差异；2荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞ROS、MDA、抗氧化酶、ATPs及SA的影响2.1荭草苷对氧化损伤红细胞ⅠROS、MDA、抗氧化酶、ATPs的影响H202诱导红细胞氧化损伤,模型组ROS荧光强度增大,MDA含量升高,抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活性降低,ATPs(Na+-K+-ATPs. Ca2+-Mg2+-ATPs)活性降低,与正常组相比,各指标均有显著性差异(P<0.01)；给予荭草苷、木犀草素、维生素C预处理后,各给药组ROS荧光强度均有不同程度减弱,MDA含量均有不同程度降低,抗氧化酶活性及ATPs活性均有不同程度升高,且与浓度呈正相关。与模型组相比,荭草苷10μg·mL-1浓度组ROS、SOD、CAT、 Na+-K+-ATPs有显著性差异(P<0.05,P<0.01),MDA、GSH-Px、 Ca2+-Mg2+-ATPs无显著性差异,荭草苷20,40μg·mL-1浓度组各指标均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；与模型组相比,木犀草素10,20,40μg·mL-1浓度组各指标均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；与木犀草素相比,荭草苷10,20μg·mL-1浓度组在降低ROS荧光强度,降低MDA含量,提高SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPs活力上弱于木犀草素同浓度组,具有显著性差异(P0.05, P<0.01), CAT、 Na+-K+-ATPs无显著性差异；二者40μg·mL-1浓度组相比各指标均无显著性差异；与维生素C相比,荭草苷与木犀草素10,20μg·mL-1浓度组在降低ROS荧光强度,降低MDA含量,提高SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPs活力上均弱于维生素C20μg·mL-1浓度组,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),CAT、Na+-K+-ATPs无显著性差异；二者40μg·mL-1浓度组与维生素C相比各指标无显著性差异。2.2荭草苷对自然老化红细胞MDA、抗氧化酶、ATPs及SA的影响红细胞37℃孵育48h后,模型组红细胞MDA含量升高,抗氧化酶及ATPs活性降低,SA含量降低,与正常组相比,各指标均具有显著性差异(P<0.01)；给予荭草苷、木犀草素、维生素C预处理后,各给药组MDA含量均有不同程度降低,抗氧化酶及ATPs活性均有不同程度升高,SA含量也有不同程度升高,与模型组相比,各指标均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),并与浓度呈正相关；与木犀草素相比,荭草苷10,20μg·mL-1浓度组在降低MDA含量,提高抗氧化酶及ATPs活力,提高SA含量上弱于木犀草素同浓度组,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组相比各指标无显著性差异；与维生素C相比,荭草苷与木犀草素10,20μg·mL-1浓度组在降低MDA含量,提高抗氧化酶及ATPs活力,提高SA含量上均弱于维生素C20μg·mL-1浓度组,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),二者40μg·mL-1浓度组与维生素C相比各指标无显著性差异。3荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞膜蛋白的影响红细胞氧化损伤后,模型组蛋白条带变窄,血影蛋白(spectrin)、锚定蛋白(ankyrin)、带3蛋白(band3protein)、带4.1a(band4.1a protein)带4.1b蛋白(band4.1b protein)、肌动蛋白(actin)均有不同程度的减弱甚至消失,与正常组有明显差别。给予荭草苷后,带3蛋白、带4.1a蛋白、肌动蛋白有所恢复,给予木犀草素后,血影蛋白、带3蛋白、带4.1a蛋白、肌动蛋白有所恢复,给予维生素C后,血影蛋白、锚定蛋白、带3蛋白、带4.1a蛋白、带4.1b蛋白、肌动蛋白均有所恢复,且蛋白恢复程度与浓度呈正相关,荭草苷蛋白恢复程度均低于木犀草素同浓度组,木犀草素40μg·mL-1浓度组与维生素C20μg·mL-1浓度组蛋白恢复程度较好。红细胞孵育48h后,模型组血影蛋白、锚定蛋白有聚集现象,带4.1a蛋白有所增加,带4.1b蛋白有所减少,4.1a/4.1b有所增大,与正常组有区别。给予荭草苷、木犀草素、维生素C预处理后,血影蛋白、锚定蛋白条带均有所恢复,4.1a/4.1b均有所降低,各组间差异不大。4荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞表面形态的影响红细胞氧化损伤及自然老化后,模型组红细胞表面形态发生变化,大部分红细胞皱缩,表面伸出很多棘状突起,边缘有锯齿状突起,并且红细胞大多粘连,还有少部分红细胞呈扁平瓜子样,细胞中心凹陷或呈平板状,较正常红细胞薄,与正常组相比有明显差别。给予荭草苷、木犀草素、维生素C预处理后红细胞形态逐渐恢复,表面棘突逐渐变细变小,棘红细胞数目变少,边缘比较整齐,且细胞恢复程度与浓度呈正相关。5荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞膜骨架的影响红细胞氧化损伤及自然老化后,模型组红细胞膜骨架结构模糊,没有网络状结构,J点不清晰,SP4结构缺失断裂或形成碎片,网络间纤维发生聚集,粗细不一,分布不均,结构难辨,与正常组相比有显著性差异。给予荭草苷、木犀草素、维生素C预保护后,红细胞膜骨架J点逐渐恢复,SP4逐渐变得完整有序,膜骨架间的空洞逐渐变小,网络骨架结构逐渐出现,且膜骨架恢复程度与浓度呈正相关。荭草苷与木犀草素高浓度组及维生素C组,J点和SP4都比较清晰,膜骨架恢复程度比较明显。综上所述,荭草苷对氧化损伤及自然老化红细胞均有一定的保护作用,且有一定的剂量依赖性。其抗氧化作用的发挥通过降低过氧化产物含量,提高抗氧化酶及跨膜离子转运酶活力,改善细胞形态,恢复细胞膜骨架结构实现；荭草苷低中浓度组抗氧化能力弱于木犀草素同浓度组,高浓度组抗氧化能力与维生素C相当。