孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD)是一组儿童期起病的终身神经发育障碍,其核心特征是社会交流、交往障碍,兴趣狭窄及刻板重复的行为,具有显著临床异质性。ASD位居儿童精神残疾之首,一般起病<3岁,在各种族、民族和社会经济群体中均有发生,近年来全球ASD的患病率呈急剧增长趋势。ASD的病因及发病机制尚不明确,既往研究显示ASD可能是由环境和遗传因素共同作用引起的儿童脑发育异常,而遗传学研究显示,ASD遗传度超过90%,因此遗传被认为是ASD的主要病因。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)作为一种重要的遗传标记,已被广泛应用于群体遗传学研究,其中SNP与ASD的关联研究一直是国内外研究热点。目前最新的理论认为神经元可塑性、突触连接功能异常可能是ASD重要的分子机制。研究表明mi RNA在神经可塑性和神经发育方面具有重要功能,近年来有学者通过挖掘与ASD相关基因3’UTR区SNP结合的mi RNA,研究ASD的发病机制。DIP2(Disco-interacting protein 2)基因家族(DIP2A,DIP2B,DIP2C)在大脑中高度表达,可以参与大脑细胞转录,改变神经元基因表达,调节突触的可塑性和认知行为,而关于DIP2家族SNP与ASD及其临床表型的关联研究,以及与DIP2家族3’UTR区易感SNP位点结合的mi RNA对ASD的影响尚无报道。目的:分析DIP2基因家族SNP与中国北方汉族儿童ASD易感性的关联,进一步分析DIP2基因家族SNP与ASD临床表型之间的关联;探索与DIP2基因家族3’UTR区易感SNP位点结合的mi RNA对ASD的影响,为探讨ASD的病因,阐明其发病机制,寻找特异分子标志物,提供依据。方法:DIP2基因家族SNP与ASD及其临床表型之间的关联分析:采用病例-对照研究设计,按照严格标准纳入1443例研究对象(715例ASD病例,728例对照),民族均为汉族,两组研究对象在性别、年龄上匹配。提取基因组DNA,应用飞行时间质谱法检测DIP2基因家族20个SNP位点(rs1007893,rs34736293,rs7279002,rs2070435,rs2255397,rs1107065,rs2248636,rs79564340,rs11169524,rs3803181,rs2280503,rs1047912,rs4768915,rs3740304,rs2288681,rs7088729,rs4242757,rs10795060,rs10904083,rs4881274)的基因型,采用,(1)卡方检验分析哈迪-温伯格定律(HWE)、两组研究对象等位基因及基因型频率分布与ASD的关联、ASD患者等位基因及基因型频率分布与病情轻重程度的关联;(2)Haploview软件分析连锁不平衡(LD)程度;(3)SNPStats在线程序分析遗传模型、单体型与ASD的关联程度;(4)GMDR软件分析基因-基因交互作用;(5)方差分析或秩和检验分基因析基因型与CARS量表ASD临床表型及ABC量表ASD临床表型的关联。DIP2基因家族3’UTR区易感SNP位点结合的mi RNA对ASD的影响:在上述研究对象中纳入ASD病例30例(男性22例,女性8例),对照30例(男性22例,女性8例),两组研究对象年龄均为5岁,提取血清mi RNA,Polymi RTS数据库搜索与DIP2基因家族3’UTR区易感SNP位点结合的mi RNA,同时筛选文献报道的ASD血清mi RNA微阵列芯片中差异表达显著的mi RNA,RT-q PCR检测并验证目标mi RNA在两组研究对象血清中的表达情况,统计学分析选用Graphpad Prism 7.0和SPSS 24.0软件,统计学检验采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.本研究共纳入研究对象1443例,ASD病例组715例(男性541例,女性174例),平均年龄为4.80±2.447岁,经CARS量表评定,轻-中度病例609例,重度病例106例;对照组728例(男性548例,女性180例),平均年龄为4.77±2.443岁。两组研究对象在性别构成、年龄分布上均衡可比(P>0.05)。2.DIP2家族20个位点的基因型分布均符合HWE(P>0.05)。3.等位基因与基因型频率分析结果显示,DIP2A:7个SNPs位点的等位基因及基因型频率在病例组和对照组中的分布差异均无统计学意义(P>0.05);DIP2B:rs11169524、rs2280503、rs4768915位点的等位基因频率,DIP2C:rs3740304、rs2288681、rs7088729、rs4242757位点的等位基因及基因型频率以及rs10795060和rs10904083位点的基因型频率,在病例组和对照组中的分布差异均有统计学意义(P<0.05)。4.遗传模型分析结果显示,DIP2A:5种遗传模型下7个SNPs位点的多态性与ASD的关联均无统计学意义(P>0.05);DIP2B:(1)rs11169524:加性遗传模型能增加ASD的发病风险,显性遗传模型中TA/AA基因型发病风险是TT基因型的1.23倍(OR=1.19,95%CI=0.91-1.57,P=0.037;ORTA/AA vs TT=1.23,95%CI=0.85-1.77,P=0.039);(2)rs2280503:加性遗传模型能增加ASD的发病风险,显性遗传模型中CA/CC基因型发病风险是AA基因型的1.25倍(OR=1.18,95%CI=1.00-1.38,P=0.045;ORCA/CC vs AA=1.25,95%CI=1.01-1.54,P=0.037);DIP2C:rs3740304,rs2288681,rs7088729位点的加性遗传模型均能增加ASD的发病风险(OR=1.21,95%CI=1.03-1.42,P=0.02;OR=1.24,95%CI=1.04-1.48,P=0.014;OR=1.23,95%CI=1.03-1.46,P=0.021)。5.DIP2家族各位点间LD程度均较高(DIP2A:0.783≤D’≤1.0,0.134≤r2≤0.976;DIP2B:0.917≤D’≤1.0,0.064≤r2≤0.994;DIP2C:0.378≤D’≤1.0,0.004≤r2≤0.954)。6.单体型分析:DIP2A:7个SNPs位点组成的多种单体型均与ASD无关联(P>0.05);DIP2B:与群体单体型频率最高的单体型相比,相邻(1)2个SNPs:rs11169524-rs3803181,组成的单体型AT(OR=1.29,95%CI=1.08-1.54,P=0.006);(2)3个SNPs:rs11169524-rs3803181-rs2280503,单体型ATC(OR=1.28,95%CI=1.07-1.54,P=0.006);rs380318-rs2280503-rs1047912,单体型TCC,TCT(OR=1.28,95%CI=1.02-1.59,P=0.031;OR=1.27,95%CI=1.01-1.59,P=0.041)(3)4个SNPs:rs11169524-rs3803181-rs2280503-rs1047912,单体型ATCC和ATCT(OR=1.29,95%CI=1.03-1.60,P=0.025;OR=1.28,95%CI=1.02-1.61,P=0.032)(4)5个SNPs:rs11169524-rs3803181-rs2280503-rs1047912-rs4768915,单体型ATCCG,ATCTG和ACCCG(OR=1.28,P=0.030;OR=1.27,P=0.043;OR=2.21,P=0.002),(5)6个SNPs:rs79564340-rs11169524-rs3803181-rs2280503-rs1047912-rs4768915,单体型CACCCG(OR=2.01,95%CI=1.20-3.36,P=0.008),均是ASD的危险因素;DIP2C:与群体单体型频率最高的单体型相比,相邻(1)2个SNPs:rs3740304-rs2288681,单体型CG(OR=1.27,95%CI=1.06-1.51,P=0.008);rs2288681-rs7088729,单体型CT(OR=1.25,95%CI=1.05-1.50,P=0.012);rs7088729-rs4242757,单体型TC(OR=1.23,95%CI=1.03-1.47,P=0.022),(2)3个SNPs:rs3740304-rs2288681-rs7088729,单体型GCT(OR=1.25,95%CI=1.04-1.49,P=0.015);rs2288681-rs7088729-rs4242757,单体型CTC(OR=1.26,95%CI=1.06-1.51,P=0.011),(3)4个SNPs:rs3740304-rs2288681-rs7088729-rs4242757,单体型GCTC(OR=1.26,95%CI=1.05-1.51,P=0.012);rs2288681-rs7088729-rs4242757-rs10795060,单体型CTCG(OR=1.28,95%CI=1.06-1.55,P=0.011);rs7088729-rs4242757-rs10795060-rs10904083,单体型TCGG(OR=1.2,95%CI=1.02-1.49,P=0.031);rs4242757-rs10795060-rs10904083-rs4881274,单体型CGGA(OR=1.25,95%CI=1.04-1.52,P=0.02),(4)5个SNPs:rs3740304-rs2288681-rs7088729-rs4242757-rs1079506,单体型GCTCG(OR=1.26,95%CI=1.04-1.52,P=0.002);rs2288681-rs7088729-rs4242757-rs10795060-rs10904083,单体型CTCGG(OR=1.28,95%CI=1.04-1.52,P=0.012);rs7088729-rs4242757-rs10795060-rs10904083-rs4881274,单体型TCGGA(OR=1.24,95%CI=1.02-1.50,P=0.028),(5)6个SNPs:rs3740304-rs2288681-rs708872-rs4242757-rs10795060-rs10904083,单体型GCTCGG(OR=1.26,95%CI=1.04-1.52,P=0.019);rs2288681-rs7088729-rs4242757-rs10795060-rs10904083-rs4881274,单体型CTCGGA(OR=1.29,P=0.01)(6)7个SNPs:rs3740304-rs2288681-rs7088729-rs4242757-rs10795060-rs10904083-rs4881274,单体型GCTCGGA(OR=1.27,95%CI=1.05-1.55,P=0.01),均是ASD的危险因素。7.基因-基因交互作用结果:由DIP2基因家族20个SNPs组成的模型rs1007893-rs1107065-rs2070435-rs2248636-rs2255397-rs34736293-rs7279002-rs1047912-rs11169524-rs2280503-rs3803181-rs4768915-rs79564340-rs10795060-rs10904083-rs2288681-rs3740304-rs4242757-rs4881274-rs7088729为基因-基因交互作用最佳模型(CVC=10/10,Tr BA=0.9108,Te BA=0.5762,P=0.001)。基因-基因交互作用树状图显示,rs4768915和rs79564340,rs2070435和rs4881274,rs1047912和rs3740304之间显现出协同作用;rs2248636和rs2280503,rs2255397和rs3803181之间显示出非加性相互作用,均能增加ASD发病风险。rs10795060和rs2288681,rs11169524和rs4242757之间不相关,不能增加ASD发病风险。8.ASD病情及临床表型分析:(1)病情程度:DIP2A rs34736293位点等位基因频率在轻-中度病例组和重度病例组中的分布差异有统计学意义(χ2=4.260,P=0.045)。(2)CARS量表ASD临床表型:DIP2A:(1)rs1007893,rs7279002,rs2070435,rs2248636位点不同基因型视觉反应评分差异具有统计学意义,(2)rs1107065位点不同基因型智力水平评分差异具有统计学意义,(3)rs2248636位点不同基因型模仿评分差异具有统计学意义;DIP2B:(1)rs79564340位点不同基因型听觉反应评分差异具有统计学意义,(2)rs79564340位点不同基因型活动水平评分差异具有统计学意义,(3)rs1047912位点不同基因型非生命的物体关系评分差异具有统计学意义,(4)rs4768915位点不同基因型智力评分差异具有统计学意义;DIP2C:(1)rs10795060,rs10904083位点不同基因型视觉反应评分差异具有统计学意义,(2)rs10795060位点不同基因型人际关系评分差异具有统计学意义(均P<0.05)。(3)ABC量表ASD临床表型:DIP2B rs1047912位点不同基因型感觉能力差异具有统计学意义(P<0.05)。9.依据上述分析结果,选择位于3’UTR区的ASD风险位点rs4768915,在Polymi RTS数据库中检索到与rs4768915位点突变型等位基因(G)结合的mi RNA为mi R-4655-3p,将其作为本课题的候选mi RNA。10.RT-q PCR检测结果显示,mi R-4655-3p在病例组血清中表达上调,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.DIP2B和DIP2C可能是ASD的遗传易感基因。2.DIP2B rs11169524、rs2280503、rs4768915位点,DIP2C rs3740304、rs2288681、rs7088729、rs4242757、rs10795060、rs10904083位点,可能是ASD发病的遗传位点。3.加性遗传模型下,DIP2B rs11169524和rs2280503位点,DIP2C rs3740304、rs2288681、rs7088729位点的多态性能增加ASD的发病风险;显性遗传模型下,DIP2B rs11169524位点的TA/AA基因型,rs2280503位点的CA/CC基因型能增加ASD的发病风险。4.DIP2B单体型包含rs11169524(A),rs2280503(C),rs4768915(G)其中任意2个SNPs,且总SNPs≥4,可能会增加ASD的发病风险;DIP2C单体型包含rs3740304(G),rs2288681(C),rs7088729(T),rs4242757(C),rs10795060(G),rs10904083(A)其中任意2个SNPs,可能会增加ASD的发病风险。5.SNPs位点(rs4768915和rs79564340,rs2070435和rs4881274,rs1047912和rs3740304,rs2248636和rs2280503,rs2255397和rs3803181)之间的交互作用能增加ASD发病风险。6.DIP2A rs34736293位点的多态性可能影响ASD病情的轻重程度。7.rs1007893,rs7279002,rs2070435,rs10904083,rs2248636,rs10795060位点与ASD视觉反应异常存在关联;rs1107065,rs4768915位点与ASD智力发育障碍存在关联;rs1047912位点与ASD非生命物体关系及感觉能力障碍存在关联;rs10795060位点与ASD人际关系障碍存在关联;rs79564340位点与ASD听觉反应异常及活动障碍存在关联。