食品中酪蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立

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本论文通过实验研究建立了食品中酪蛋白的双抗体酶联免疫检测方法。首先,本论文选择酪蛋白标品作为半抗原,通过免疫新西兰大耳白兔获得了具有较高效价和特异性的酪蛋白抗血清,并通过免疫小鼠、细胞融合及细胞克隆制备了具有高效价和高特异性的酪蛋白腹水,使用免疫亲和层析法纯化分别获得了抗酪蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体。其中多克隆抗体效价均为729000,与其它类似蛋白及本论文中涉及到的蛋白没有交叉反应;并成功地制备了两株单克隆抗体2H7和2D6,它们的效价分别为729000和2187000且均具有很好的特异性。进一步采用过碘酸钠法将多克隆抗体与辣根过氧化物酶连接制得酶标抗体,通过对ELISA各种条件进行优化,分别建立了间接酪蛋白检测ELISA和双抗体夹心ELISA标准曲线。间接ELISA方法检出限为21ppb,双抗体夹心ELISA方法检出限为7ppb,板内和板间变异系数均低于18%。交叉反应实验结果显示,酪蛋白与其它相关蛋白交叉反应率均小于0.01%,说明抗体特异性较高。在建立检测酪蛋白双抗体夹心ELISA法的基础上,选取牛奶、咖啡等11种样品为研究对象,分别进行酪蛋白含量检测,并选择其中4种样品在25,100,200μg/kg三个添加水平上的测得的添加回收率为65%-80%,说明本实验方法准确有效。论文通过采用Bradford法与所建立的双抗体夹心ELISA方法进行了比较,检测结果表明:酪蛋白标准品经两种方法检测所得结果的线性相关系数R2=0.9989,因此进一步验证了本论文所建立的酪蛋白双抗体夹心ELISA法的准确性较好。本论文进一步对酪蛋白快速检测试剂盒稳定性进行了研究,分别对单克隆抗体和酶标抗体的稳定性进行了研究,抗体和酶标抗体可在4℃条件下放置6个月以上保持检测性能基本不变,为进一步开发并研制快速检测酪蛋白试剂盒奠定了基础。
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