目的：　　1.对收集到的非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing loss，NSHL)病例进行线粒体12S rRNA基因突变筛查，统计分析线粒体12S rRNA基因突变情况。　　2.对样本中筛查到的1例既携带线粒体12S rRNA A1555G突变，又携带tRNAThrT15943C突变的中国汉族耳聋家系进行临床和分子遗传学评估，探讨tRNAThrT15943C突变对A1555G突变的耳聋的表型表达的影响。　　3.构建携带线粒体tRNAThr T15943C突变的永生化淋巴母细胞系(lymphoblastoidcell lines，LCLs)，一方面永久保存我国宝贵的聋病资源;另一方面进行部分细胞功能实验，深入研究T15943C突变与耳聋的关系，为耳聋的诊断及预防提供流行病学数据。　　方法：　　1.在患者及其家属知情同意的情况下，收集温州医科大学各大合作医院耳鼻咽喉科门诊及特殊聋校NSHL患者血样3029份，正常对照血样512份。　　2.提取所收集血样的全基因组DNA，并对线粒体12S rRNA基因进行常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增、产物纯化及测序，运用生物信息软件将测序结果与标准序列比对，统计变异情况。　　3.对筛查到的所有携带线粒体12S rRNAA1555G突变的先证者进行线粒体基因组全序列分析，然后依据东亚线粒体单体型进化树做单体型分析和分类。　　4.对筛查到的1例同时携带线粒体12S rRNA A1555G和tRNAThr T15943C突变的中国汉族耳聋家系WL008家系进行详细的家系调查，完善家系成员的临床资料，从临床和分子遗传学角度进行分析评估。　　5.运用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)转化人外周血B淋巴细胞(B lymphocytecell，BLC)的方法，构建3组单体型相同但携带不同突变位点的永生化淋巴母细胞系。　　6.利用流式细胞仪对成功构建的LCLs进行细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和线粒体膜电位（mitochondridal membrane potential，MMP）检测，并绘制加半乳糖和葡萄糖后的细胞倍增时间(doubling time，DT)。　　7.统计分析3组LCLs在ROS、MMP和DT等细胞功能方面的差异性。　　结果：　　1.对采集的全部NSHL患者和正常对照者血样进行线粒体12S rRNA基因突变筛查发现，共109例NSHL患者携带线粒体12S rRNAA1555G突变。　　2.对这109例携带12S rRNAA1555G突变的先证者进行线粒体全序列分析，然后结合单体型进化树分析，统计发现有2例均为东亚线粒体单体型F，其中1例仅携带线粒体12S rRNAA1555G突变（编号:NB079），另1例除了携带A1555G突变外，还携带tRNAThr T15943C突变（编号:WL008）。　　3.对既携带A1555G突变，又携带T15943C突变的中国汉族耳聋家系WL008家系进行临床和分子遗传学评估，证实该家系与母系遗传特征相符，且母系成员的听力损失程度从正常、重度到极重度不等，听力图结构包括平坦型和斜坡型。　　4.线粒体基因组全序列分析结果显示，除了已报道的A1555G和未报道的tRNAThrT15943C突变位点，WL008家系先证者还携带33个已报道的多态性位点，9个位于D-Loop区，5个位于rRNA，19个位于蛋白编码区。其中错义突变共6个，均位于蛋白编码区，其他的均为无义突变。而GJB2基因筛查后未发现任何致病位点。　　5.与其他物种线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的种系发育分析学进行分析，发现tRNAThrT15943C突变在人类、小鼠、牛和非洲爪蟾的进化上是高度保守的，而其他变异位点均不保守。此外，对tRNAThrT15943C突变在16个灵长类物种中进行保守性分析，结果显示保守性指数(Conservation Index，CI)高达94％。进一步的单体型进化树分析证实，该家系属于东亚线粒体单体型F。　　6.与另一个同为F单体型但未携带继发突变位点的A1555G耳聋家系NB079家系比较发现，WL008家系的耳聋外显率较高。　　7.细胞功能实验表明，WL008家系和NB079家系细胞的ROS水平均比正常对照组的高，MMP则较正常对照组下降，其中携带tRNAThrT15943C突变的WL008家系比不携带该突变的NB079家系ROS水平高1.49％，MMP下降13.53％; DT结果显示，当培养液中含有半乳糖或葡萄糖时，两组突变组细胞的生长速度均比正常对照组下降，且WL008家系细胞比NB079家系细胞的生长速度下降更明显，比NB079家系分别下降20.48％和15.78％。　　结论：　　1.在109例携带线粒体12S rRNAA1555G突变的NSHL患者中，仅1例携带tRNAThrT15943C突变，且在512例正常对照样本中均未发现该突变位点，推测tRNA ThrT15943C突变可能与耳聋相关。　　2.种系发育分析学表明，T15943C突变在16个灵长类物种中高度保守，而从tRNAThr二级结构图可知，15943位点位于T茎结构上，正常情况下，该位置的T碱基与第48位的A碱基会形成高度保守的T-A碱基配对，当15943位点发生T-C突变时，可破坏该碱基配对，从而影响tRNAThr二级结构的稳定性，引起线粒体的功能发生障碍，最终诱发耳聋。　　3.WL008家系中母系成员的听力损失程度和听力曲线具有差异性，提示核背景对A1555G突变的表型有修饰作用。但在该家系中，未在GJB2基因上发现致病突变位点，故可排除与耳聋高度相关的GJB2基因对该家系A1555G表型的修饰作用。　　4.单体型进化树分析显示，WL008家系和NB079家系均属于东亚线粒体单体型F，且两者均携带A1555G同质性突变，但同时携带tRNAThrT15943C突变的WL008家系比不携带该突变位点的NB079家系的耳聋外显率高，提示tRNAThr T15943C突变可能是一个与耳聋相关的新的继发突变位点，与A1555G突变协同作用，影响耳聋表型的表达。　　5.成功构建的WL008家系、NB079家系和正常对照组细胞的部分功能试验初步证实，当个体携带线粒体tRNAThrT15943C突变时，导致的细胞功能异常更显著。推测可能是由于T15943C突变对细胞内的多种酶的含量或活性产生了影响，造成呼吸复合体的活性下降，使线粒体的氧化供能过程受到阻碍，最终引起严重的线粒体功能障碍，从而进一步证实了tRNAThrT15943C突变与耳聋的相关性，但其具体机制还有待深入研究。