近年来,随着水产养殖业的发展,草鱼养殖规模不断扩大,但是养殖环境却有恶化的趋势,草鱼在养殖过程中爆发的疾病越来越多,给草鱼养殖业带来了极大的经济损失,严重制约了草鱼养殖业的可持续发展。培育具有一定抗病力的草鱼新品系是解决病害问题的有效途径,也是实现水产养殖行业健康发展的一种趋势。天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)基因作为一种抗病候选基因,与鱼类的先天性免疫密切相关,在鱼类的抗病研究中具有重要价值。天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内病原菌侵染的天然免疫相关蛋白。目前在人和小鼠等哺乳动物中已发现两种具有不同功能的天然抗性巨噬蛋白Nramp1和Nramp2。但在鱼类中,除虹鳟(Nrampα和Nrampβ)外,发现的Nramp蛋白只有一种,氨基酸序列对比分析研究表明,鱼类的Nramp基因与哺乳类Nramp2的同源性要高于Nramp1的同源性,但其功能却与Nramp1相似。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为试验材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对比研究了Nramp基因在草鱼胚胎不同发育阶段、不同组织及嗜水气单胞菌攻毒感染后不同时间四个免疫相关组织的差异表达情况;通过RT-PCR技术获得草鱼Nramp基因ORF区,并进行了原核表达,对重组蛋白进行纯化;用克隆测序的方法筛选与抗病性状相关的SNP位点,为进一步研究Nramp的功能、生物学活性和表达调控机制,为揭示草鱼免疫系统抗感染机制奠定了基础,为草鱼抗病品系的培育提供参考。主要研究结果如下:在草鱼胚胎发育的不同时期(卵裂期、囊胚期、原肠胚期、体节期、心跳期、孵化期和幼鱼期)Nramp基因的mRNA表达量随着随着胚胎的不断发育而逐渐增强且变化显著(P<0.05),在幼鱼期表达量达到最大。Nramp基因在成年健康草鱼的13个不同组织中均有不同程度的表达,在肝脏中的表达量最高;其次是在脾、头肾、肠中的表达量较高;而在眼和鳔中的表达量最低。在实验室条件下,对草鱼进行人工感染嗜水气单胞菌后,在头肾、肝脏、脾脏、肠中Nramp的表达量都有显著变化(P<0.05),在头肾中感染12h后显著上升,48h达到最大,在72h和96h时又显著下调,在7d时表达量继续下调而逐渐回归到初始水平;在肝脏中Nramp基因的表达量在4h时出现下调,在12h又显著上调,随后在24h出现下调,在48h又上调,72h达到最大并保持较高水平到7d;在肠中mRNA表达量在12h显著上调,48h达到最大,在72h和96h显著下调,在7d时表达量基本回归到初始水平;在脾中mRNA表达量在4h开始上升,12h达到最大,在24h和48h表达水平显著下调,在7d时表达量回归到初始水平。草鱼感染致病菌可引起免疫相关组织中Nramp的表达量上升,说明Nramp在硬骨鱼类的天然免疫反应过程中发挥着重要作用。从草鱼组织中提取总RNA,反转录获得cDNA后,利用设计的引物扩增Nramp基因ORF区642bp片段,将目的片段双酶切后连接到pET-32a(+)原核表达载体上,经酶切和测序验证,表明成功构建了pET-32a-Nramp原核表达载体。将重组载体转化到表达菌株BL21中,结果发现在0.5 mM/L IPTG诱导6 h后Nramp重组蛋白获得大量表达,且以包涵体形式存在。通过HisTrap HP纯化柱纯化后获得与预期大小一致的片段,经过Western blotting验证了纯化的蛋白是目的蛋白。这为Nramp单克隆抗体的制备和利用免疫组化及免疫印迹技术在蛋白水平研究Nramp基因表达量的变化奠定了基础。通过PCR克隆测序的方法筛选草鱼Nramp基因多态性位点,经比对分析发现在Nramp基因3’UTR区发生C2419T突变,产生两种基因型AA基因型和AB基因型。为研究该多态性位点与草鱼抗病的相关性,分别对40条AA基因型和40条AB基因型鱼进行嗜水气单胞菌感染实验,不同时间采血制备血清检测这两种基因型的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、碱性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性四项免疫指标,发现AA基因型、AB基因型这四种酶的活性都有显著升高(P<0.05)。碱性磷酸酶活性在AA基因型与AB基因型之间无显著差异(P>0.05),AA基因型与AB基因型的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性只在个别时间点有显著差异(P<0.05)。初步研究结果显示,所发现的Nramp基因的多态性位点与草鱼的抗病相关性不显著,尚需要扩大样本量进行深入研究。