抑癌蛋白p53是目前已知与人类肿瘤发生发展最为密切相关的分子之一,也是控制细胞增殖、凋亡的蛋白网络的节点分子。在机体受到细胞应激如DNA损伤、癌基因激活、化学药物处理、热/冷休克等多种因素的刺激下,p53作为一种重要的转录因子,被激活,选择性调控其下游与细胞周期阻滞、细胞凋亡或DNA损伤修复相关的靶基因的表达,引起细胞周期阻滞或诱导细胞凋亡。多种分子能够通过与p53相互作用选择性调控其靶基因,如Hzf、CAS/CSE1L、ASPP1和ASPP2等。对p53的精密调节在维持细胞的正常生长和防止癌变等方面起着非常重要的作用。含有KRAB(Kruppel-associated box)结构域的锌指蛋白(KZNF)是人类基因组中最大的转录调控因子家族,KZNF通过与其转录抑制辅因子KAP-1(KRAB box-associated protein-1)及其它转录因子结合,发挥特异的转录抑制功能。本实验室的前期研究鉴定了一个新的KZNF成员,命名为Apak(ATM and p53 associated KZNF protein),它是一种新的p53负调控分子,非应激条件下,Apak通过其锌指区和KRAB结构域分别与p53和KAP-1相结合,KAP-1招募蛋白激酶ATM和组蛋白去乙酰化酶HDAC1复合物抑制p53的乙酰化,从而下调p53的转录因子活性,更为重要的是,Apak选择性地下调p53的凋亡相关靶基因表达,抑制p53介导的细胞凋亡,而对细胞周期没有调控作用。同时我们还发现非应激条件下,Apak抑制p53活性依于ATM的存在,在DNA损伤条件下,Apak又依赖ATM对其的磷酸化与p53解离、从而解除对p53的抑制、激活p53,因此揭示了ATM在p53调控中的双重作用。这些前期结果揭示了KZNF家族成员在p53选择性调控中的重要功能及其分子机制。作为哺乳动物中最大的转录调控因子家族,其成员数量多达400多个,除了Apak外,还有多少成员可具有类似Apak的功能参与p53调控,各成员间的协同关系又是怎样的都还很不清楚,这些也正是本课题拟探讨的科学问题。本论文首先利用生物信息学方法从KZNF家族423个成员筛选出含有ATM底物磷酸化位点SQ/TQ模序的48个成员,进行了进化树分析,明确了它们在起源进化上的关系。随后成功构建了其中的21个成员的真核细胞表达质粒,利用报告基因活性分析体系检测了这21个成员对p53转录因子活性的调控,筛选得到5个成员(即ZNF8、ZNF195、ZNF248、ZNF566、ZNF568)对p53的转录因子活性具有较强的下调作用。最后又根据KRAB结构域类型和对p53转录活性抑制效果的不同选择了21个KZNF成员的部分分子,通过蛋白-蛋白相互作用技术研究了它们与p53、ATM的结合关系,在检测的12个成员中8个可以和p53相互作用,在检测的4个成员中,2个可以和ATM相互作用,能够同时与ATM和p53相互作用的KZNF蛋白均可以显著下调p53转录因子活性,表明KZNF家族中的确存在类似Apak的同源分子,它们对p53的调控功能与其结合ATM、p53的能力密切相关。综上,本论文在实验室前期研究基础上,进一步研究了KZNF家族在重要抑癌蛋白p53复杂调控网络中的可能作用,序列分析搜索到了全部48个可能作为候选ATM底物的KZNF成员,成功克隆了其中的21个成员,筛选出多个对p53活性具有抑制功能的分子,从而进一步证实KZNF家族确实存在更多的p53调控蛋白。本研究对加深理解KZNF家族的生理功能具有重要的原创性价值,有助于解释p53调控的时空复杂性,为靶向p53及其调控分子的肿瘤治疗提供了更多的科学认识。