β肌动蛋白(B-actin)基因为管家基因，其启动子具有广泛启动表达功能。β-actin启动子具有与SV40早期启动子相当甚至更强的启动转录活性，因此成为转基因研究的重要启动子之一。唐鱼(Tanichthys albonubes Lin)是我国特有的小型鲤科鱼类，具有较高的观赏价值。本实验分离了二种不同长度的唐鱼β-actin启动子序列，分别构建了红色荧光蛋白表达载体，同时利用转基因技术，检测比较二种启动调控序列的转录启动功能，以期获得具有强启动功能的唐鱼β-actin启动子，为唐鱼的自源功能基因转化打下基础，同时获得具有更高观赏价值的转红色荧光蛋白基因唐鱼。主要研究内容如下： 1.利用高保真PCR技术克隆了唐鱼、斑马鱼(Danio rerio)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)β-actin基因的5端侧翼区启动调控区及部分开放阅读框。测序结果表明，所克隆的三种鱼β-actin基因片段长度分别为1464bp、1654bp和1733bp，包含长为1.3kb、1.5kb及1.6kb的启动调控区以及90bp的部分开放阅读框。启动调控区均包括一段长约为105bp的B-actin近端启动子以及β-actin基因第一个不翻译的外显子和第一个内含子。BLAST结果显示，此开放阅读框片段所编码的30个氨基酸具有高度的保守性，其中唐鱼与斑马鱼的同源性为100％；与尼罗罗非鱼的同源性为96.7％。在5端的非翻译区含有与大多数鱼类相同的与转录密切相关的几个转录元件：CAAT box、CArG box和TATA box，其位置分别在转录起始位点(+1)上游的-89，-59，-26处左右。 2.通过基因重组，将所获得的唐鱼和斑马鱼β-actin基因启动子定向克隆到不含启动子的红色荧光蛋白(RFP)表达载体pDsRed2-1的多克隆位点上，分别构建RFP表达载体pTA-DsRed和pZA-DsRed。采用显微注射法将线性化的重组表达载体分别注射到唐鱼的受精卵中，利用荧光显微镜观察外源基因RFP在唐鱼中的表达。结果表明RFP在转pTA-DsRed基因唐鱼表达的阳性率较高，平均为36.4％，且RFP的表达水平较高，有些孵化出膜72h的仔鱼整个躯干都可见红色荧光。RFP在转pZA-DsRed基因唐鱼中的表达水平较转pTA-DsRed基因唐鱼的低，其阳性率平均为16.9％，极显著低于转pTA-DsRed基因唐鱼(P<0.01)。 3.采用PCR、RT-PCR以及Southern blot等技术对肉眼可见红色荧光的2尾4月龄转pTA-DsRed基因唐鱼外源基因的整合和表达情况进行了检测。转基因唐鱼眼、肌、鳍及内脏等的基因组DNA进行RFP基因的PCR扩增及扩增产物的 Southern blot检测，结果在所检测的组织器官中均能检测到RFP基因；而采用RT-PCR技术以及Southem blot验证显示其中一个体所检测的组织器官均有RFP的表达，另一个体在除鳍外的其他组织器官也均有表达；Southern blot检测肌肉组织基因组DNA显示有比阳性载体分子大的杂交条带，未检测到小分子杂交带。实验表明在所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合，但在有些组织中存在表达水平较低或者不表达的现象。 4.应用基因组步移(Genome Walker)技术，根据已获得的1.3kb的唐鱼β-actin基因启动子序列，进一步分离到唐鱼β-actin基因5侧翼长为1.7kb的远端启动子序列，最终获得总长度为3.0kb的唐鱼β-actin基因启动调控序列。将其定向克隆到不含启动子的RFP表达载体pDsRed2-1中，构建了重组RFP表达载体pTLA-DsRed，采用显微注射法将线性化的重组表达载体注射到唐鱼的受精卵中，利用荧光显微镜观察外源基因RFP在唐鱼中的表达。结果显示RFP在转pTLA-DsRed基因唐鱼表达的阳性率较高，平均为35.1％，在有些刚出膜的转pTLA-DsRed基因唐鱼体表肉眼即可观察到红色荧光，在荧光显微镜下整个体表可见明显的红色荧光。采用RT-PCR半定量分析比较出膜后72h的转pTLA-DsRed和转pTA-DsRed唐鱼中RFP mRNA的表达水平，结果显示转pTLA-DsRed唐鱼中RFP的表达量比转pTA-DsRed唐鱼的高35.7％。实验显示长度为3.0 kb的启动调控序列具有更强的驱动外源基因在唐鱼体内表达的活性，推测唐鱼β-actin 5远端启动子序列中存在着转录的正调控元件。 本实验分离并证实了二种不同长度的唐鱼β-actin基因启动子在唐鱼体内均具有启动外源基因转录的活性，且长度为3.0 kb的启动调控序列具有更强的驱动活性。本实验为下一步开展功能基因的转化研究奠定基础。