论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是导致猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的致病病原,PRRSV对易感细胞有着严格的细胞趋向性,该病毒主要感染单核-巨噬细胞系,包括其天然易感宿主细胞--猪肺泡巨噬细胞(PAMs)。PRRSV入侵易感细胞系需要多种因子的介导,包括CD163,非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9),唾液酸黏附素(Sn),硫酸乙酰肝素(HS),Vimentin,CD151,CD209等。前人以及本实验室的研究结果显示,CD163和MYH9是PRRSV入侵易感细胞的两个不可或缺的受体或辅助受体蛋白,但是这两个蛋白在病毒感染过程中是否存在相互作用还未可知。因此,本研究对CD163与MYH9的相互作用及其在PRRSV入侵易感细胞系中的作用机制展开了一系列的探讨。主要得到以下结果:1.通过免疫共沉淀实验,我们发现CD163和MYH9在PRRSV天然宿主细胞PAMs中存在相互作用现象,并且该互作并不依赖于病毒的感染状态。2.在HEK293T细胞中,我们将构建的CD163和MYH9截短表达质粒共转染,免疫共沉淀实验结果表明CD163氨基端4个串联重复的SRCR结构域SRCR1-4与MYH9羧基端区域PRA之间存在相互作用。3.由于SRCR1-4与PRA之间的互作是通过免疫共沉淀鉴定的,因此该互作复合物可能是由中间调节蛋白介导的,为了验证该猜测的真实性,我们通过原核表达系统表达并纯化了SRCR1-4和PRA蛋白,并通过ELISA和Far-Western Blot实验验证了SRCR1-4与PRA之间的相互作用是直接的,并非由其他因子介导。4.为了验证SRCR1-4与PRA的互作在PRRSV感染过程中发挥的作用,我们构建了稳定表达CD163,SRCR1-4,SRCR5-CT的HEK293T细胞系,我们在该细胞系中验证了猪源CD163与人源MYH9之间的互作。通过在该细胞系中进行的病毒吸附,内化,解离以及复制过程,我们发现SRCR1-4与MYH9之间的互作在PRRSV的内化过程中发挥着重要的作用。5.我们还发现外源重组的SRCR1-4蛋白与PAMs孵育后,可以与该细胞膜中分布的MYH9发生互作,并且加入SRCR1-4蛋白后,PRRSV在PAMs中的内化显著降低,并最终导致病毒的感染水平下降。6.通过将PRA区域进行截短,我们证明了SRCR1-4与PRA的111-210aa区域(PRA100)有直接的相互作用。并且我们成功构建了稳定分泌表达PRA100蛋白的293s悬浮细胞系,从该细胞系中,我们获得了纯度较高的PRA100蛋白。同时,我们还构建了稳定分泌表达CD163胞外区结构域SRCR1-PSTII蛋白的293s悬浮细胞系,并纯化得到了纯度较高的SRCR1-PSTII蛋白。这两个蛋白的获得,将有助于我们开展CD163与MYH9互作的结构生物学研究。综上所述,本研究证明了CD163与MYH9在细胞内的相互作用,并且二者的互作区域位于CD163氨基端结构域SRCR1-4与MYH9羧基端区域PRA之间。进一步的研究表明,CD163与MYH9的互作对PRRSV在易感细胞中的内化过程中发挥着重要的作用。这些研究结果为我们更深入的了解PRRSV的细胞入侵机制提供了新的思路。