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氧化损伤是很多重要疾病的病源,对人类健康造成严重威胁,因此寻找一种具有抗氧化效果,且对机体无毒害作用的药物成为当务之急。红景天和灵芝是多年生草本植物,是我国传统的药用植物,具有丰富的生物学活性,已成为人们研究的焦点。
本论文以西藏波密红景天和灵芝为原材料,采用热回流法,直接以DPPH和羟自由基清除率,及灵芝多糖为标准,设计单因素和正交试验,进行抗氧化活性成分提取;通过紫外光谱、紫外显色反应等方法分析提取物中主要活性成分;MTT法测定体外培养宫颈癌HeLa细胞抑制率,研究红景天、灵芝单味药及组合药的抗肿瘤作用,筛选用于抗氧化实验的药物浓度;用H2O2刺激HeLa细胞,建立氧化损伤模型,检测红景天、灵芝单味药及组合药的抗氧化效果;最后通过测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)水平及乳酸脱氢酶(LDH)释放率,探究抗氧化机制。结果如下:
1、红景天、灵芝抗氧化活性物质提取工艺条件研究。(1)红景天提取工艺条件:料液比是1:20,乙醇体积份数是50%,提取温度是80℃,提取时间是1.5h,提取2次;(2)灵芝提取工艺条件:料液比是1:30,提取温度是90℃,提取时间是1.5h,提取2次。
2、红景天、灵芝提取物中活性成分分析。结果表明:(1)总萜类是红景天提取物的主要活性成分,含量是(570.20±20.66)mg·g-1。还含有少量的蛋白质、红景天苷、17种游离氨基酸;(2)灵芝提取物中主要活性成分是灵芝多糖类,含量是(443.13±29.43)mg·g-1。此外,灵芝提取物中除了含有少量核酸和黄酮类外,也含有17种游离氨基酸。
3、红景天、灵芝单味药及组合药对宫颈癌HeLa细胞抑制作用研究。研究发现:(1)药物浓度为50.00μg·mL-1时,红景天对HeLa细胞和293T细胞没有显著的抑制作用(p>0.05),灵芝对HeLa细胞有显著的抑制作用(p<0.05)。药物浓度为≥100.00μg·mL-1时,红景天和灵芝对HeLa和293T细胞均具有极显著的抑制作用(p<0.01),但是红景天处理后细胞抑制率≥42.91±1.84,而灵芝处理后细胞抑制率≥11.48±1.02,且当灵芝浓度达到600μg·mL-1时,细胞抑制率是43.01±1.20,说明红景天对HeLa的抑制的能力显著强于灵芝,同时也说明灵芝对细胞具有保护作用;(2)通过普通光学显微镜观察发现,红景天和灵芝对HeLa细胞的抑制机制存在不同之处;(3)红景天和灵芝质量比在3:1~3:3范围内,随着灵芝含量的增加,HeLa细胞和293T细胞抑制效果减弱,其中质量比3:2的组合药对293T细胞的抑制效果最小。(即药物浓度达到200μg·mL-1时对293T细胞有显著的抑制效果(p<0.05),但抑制率也是小于10.00的。)
4、红景天、灵芝单味药及组合药的抗氧化作用研究。发现:(1)红景天、灵芝组合药对H2O2损伤HeLa细胞修复效果明显强于单味药;(2)红景天、灵芝质量比为3:2的组合药,浓度为10.00μg·mL-1时,较模型组,细胞存活率显著增大(P<0.05),且细胞形态明显恢复;(3)质量比为3:3的组合药,浓度为5.00μg·mL-1时,细胞存活率显著增大(P<0.05)。由于红景天、灵芝质量比为3:3的组合药对293T细胞的抑制效果显著强于3:2,同时普通光学显微镜观察结果显示质量比3:2的组合药处理后细胞形态恢复效果最明显,故而最终确定红景天、灵芝最佳抗氧化组合药是:红景天、灵芝质量比为3:2。
5、H2O2损伤HeLa细胞修复机制的研究(抗氧化机制)。本论文通过测定细胞中SOD、GSH-Px活性、MDA含量、LDH释放率以及ROS相对含量,研究红景天、灵芝质量比3:2组合药对H2O2损伤的HeLa细胞的修复机制。结果显示组合药作用于HeLa细胞后,HeLa细胞中SOD、GSH-Px活性显著的增强,MDA含量、LDH释放率以及ROS相对含量显著降低。上述结果说明红景天、灵芝质量比3:2组合药能够提高损伤细胞自身的抗氧化酶活性、直接清除氧化损伤产生的过量的活性氧、减轻细胞膜脂质的过氧化反应恢复细胞膜正常物质运输功能。
本论文以西藏波密红景天和灵芝为原材料,采用热回流法,直接以DPPH和羟自由基清除率,及灵芝多糖为标准,设计单因素和正交试验,进行抗氧化活性成分提取;通过紫外光谱、紫外显色反应等方法分析提取物中主要活性成分;MTT法测定体外培养宫颈癌HeLa细胞抑制率,研究红景天、灵芝单味药及组合药的抗肿瘤作用,筛选用于抗氧化实验的药物浓度;用H2O2刺激HeLa细胞,建立氧化损伤模型,检测红景天、灵芝单味药及组合药的抗氧化效果;最后通过测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)水平及乳酸脱氢酶(LDH)释放率,探究抗氧化机制。结果如下:
1、红景天、灵芝抗氧化活性物质提取工艺条件研究。(1)红景天提取工艺条件:料液比是1:20,乙醇体积份数是50%,提取温度是80℃,提取时间是1.5h,提取2次;(2)灵芝提取工艺条件:料液比是1:30,提取温度是90℃,提取时间是1.5h,提取2次。
2、红景天、灵芝提取物中活性成分分析。结果表明:(1)总萜类是红景天提取物的主要活性成分,含量是(570.20±20.66)mg·g-1。还含有少量的蛋白质、红景天苷、17种游离氨基酸;(2)灵芝提取物中主要活性成分是灵芝多糖类,含量是(443.13±29.43)mg·g-1。此外,灵芝提取物中除了含有少量核酸和黄酮类外,也含有17种游离氨基酸。
3、红景天、灵芝单味药及组合药对宫颈癌HeLa细胞抑制作用研究。研究发现:(1)药物浓度为50.00μg·mL-1时,红景天对HeLa细胞和293T细胞没有显著的抑制作用(p>0.05),灵芝对HeLa细胞有显著的抑制作用(p<0.05)。药物浓度为≥100.00μg·mL-1时,红景天和灵芝对HeLa和293T细胞均具有极显著的抑制作用(p<0.01),但是红景天处理后细胞抑制率≥42.91±1.84,而灵芝处理后细胞抑制率≥11.48±1.02,且当灵芝浓度达到600μg·mL-1时,细胞抑制率是43.01±1.20,说明红景天对HeLa的抑制的能力显著强于灵芝,同时也说明灵芝对细胞具有保护作用;(2)通过普通光学显微镜观察发现,红景天和灵芝对HeLa细胞的抑制机制存在不同之处;(3)红景天和灵芝质量比在3:1~3:3范围内,随着灵芝含量的增加,HeLa细胞和293T细胞抑制效果减弱,其中质量比3:2的组合药对293T细胞的抑制效果最小。(即药物浓度达到200μg·mL-1时对293T细胞有显著的抑制效果(p<0.05),但抑制率也是小于10.00的。)
4、红景天、灵芝单味药及组合药的抗氧化作用研究。发现:(1)红景天、灵芝组合药对H2O2损伤HeLa细胞修复效果明显强于单味药;(2)红景天、灵芝质量比为3:2的组合药,浓度为10.00μg·mL-1时,较模型组,细胞存活率显著增大(P<0.05),且细胞形态明显恢复;(3)质量比为3:3的组合药,浓度为5.00μg·mL-1时,细胞存活率显著增大(P<0.05)。由于红景天、灵芝质量比为3:3的组合药对293T细胞的抑制效果显著强于3:2,同时普通光学显微镜观察结果显示质量比3:2的组合药处理后细胞形态恢复效果最明显,故而最终确定红景天、灵芝最佳抗氧化组合药是:红景天、灵芝质量比为3:2。
5、H2O2损伤HeLa细胞修复机制的研究(抗氧化机制)。本论文通过测定细胞中SOD、GSH-Px活性、MDA含量、LDH释放率以及ROS相对含量,研究红景天、灵芝质量比3:2组合药对H2O2损伤的HeLa细胞的修复机制。结果显示组合药作用于HeLa细胞后,HeLa细胞中SOD、GSH-Px活性显著的增强,MDA含量、LDH释放率以及ROS相对含量显著降低。上述结果说明红景天、灵芝质量比3:2组合药能够提高损伤细胞自身的抗氧化酶活性、直接清除氧化损伤产生的过量的活性氧、减轻细胞膜脂质的过氧化反应恢复细胞膜正常物质运输功能。