为研究我国鸡痘病毒疫苗毒和野毒分离株中禽网状内皮增生症病毒序列(reticuloendotheliosis virus, REV)的整合情况,本文分离和收集了一些整合有REV的痘病毒疫苗毒株及野毒株,对这种自然重组现象在病毒变异和演化上的普遍意义和流行病学意义做了一些探索,并以此为基础,运用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组鸡痘病毒GFP-FPV病毒,为制备纯化的痘病毒疫苗奠定基础。1国内外鸡痘疫苗毒基因组中REV序列整合的研究本试验收集国内外10家厂家生产的10株鸡痘弱毒疫苗和282E4株,先后在SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞(CEF)上传代增殖,用REV单抗进行间接免疫荧光试验(indirect immuo-fluoresence assay, IFA),并提取病毒DNA,根据已发表的FPV整合REV前病毒基因组序列的位点,设计合成了1对分别位于FPV基因组中201和203ORF的引物,经PCR扩增,发现不同的FPV疫苗株可得到400 bp、700 bp、1400bp、1700bp、2000bp、2500bp、5000bp、8000bp等大小不等的一个或数个片段。将1400bp、1700bp的扩增片段克隆、测序和序列分析,发现这些扩增片断均为FPV与REV的重组产物,整合的REV序列随扩增片断不同而异,不同疫苗株整合的REV前病毒基因序列大小也不同,这些整合的REV序列大小为LTR的191bp或504bp等,与国外已经测定的痘病毒毒株的同源性不仅高达98-99%,而且整合的位点也完全一致;与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为:99.6%、98.0%和87.3%,与我国REV分离株HA9901的同源性为83.6%。进一步分析表明REV与FPV之间的整合模式至少有4种。2鸡痘野毒基因组中整合REV全序列的测定和分析根据已发表的REV和FPV序列设计9对引物,从疑似鸡群中分离了26株鸡痘野毒,从中选择了8株进行PCR扩增,分别扩增REV5个基因的部分片段,并挑选安丘株和平度株这2株荧光抗体试验呈现阳性的痘病毒,扩增其整合的REV前病毒全序列,并与已发表的REV毒株进行比较,发现安丘株全长7941bp,在痘病毒基因组上的起始位点为LTR的第30位碱基,3’端LTR在痘病毒基因组上的终止位点为LTR的第213位碱基,相对于全长8221bp的REV前病毒(AF246698.2),3’端的LTR长度明显缩短。平度株比安丘株少3个碱基,并有8个碱基的差异。安丘株与国外的毒株DQ387450.1(APC-566)、AF246698.2、AY842951.1(HA9901)、DQ003591.1(SNV)及REV序列高度同源,为97-99%。进化树比较表明安丘株和平度株很可能是目前流行的痘病毒野毒株。3人工构建不含REV的重组鸡痘疫苗株利用整合有REV LTR的痘病毒282E4株作为原始病毒,选取其REV稳定整合的痘病毒201和203阅读框做同源重组区域,以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein)做为报告基因,与痘病毒启动子p7.5一起构建了psk-p7.5-EGFP-203-201的重组质粒。将重组质粒转染已感染282E4的CEF中进行病毒同源重组,结果在荧光显微镜下观察到了呈现绿色荧光的重组痘病毒,进一步以96孔板稀释法筛选获得了表达绿色荧光蛋白的重组痘病毒,为继续深入研究痘病毒中整合的REV序列特性及痘病毒野毒株的致病机理奠定了基础。