论文部分内容阅读
目的:砷是一种在自然界中常见的类金属元素,主要通过饮水、燃煤、职业暴露等途径进入人体。机体长期暴露于高砷环境会引起全身多器官、多系统功能损伤,增加Ⅱ型糖尿病、恶性肿瘤等代谢性疾病的患病风险。砷是明确的氧化应激刺激物,可以引起活性氧（Reactive oxygen species,ROS）表达升高,从而引起细胞氧化还原稳态失衡。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）具有自我更新和多向分化的特点,是砷毒性作用的重要靶细胞。据此,本研究利用原代小鼠骨髓间充质干细胞（mouse bone marrow MSCs,m BM-MSCs）作为细胞模型,使用NaAsO2干预m BM-MSCs成脂分化过程,探索环境相关剂量砷暴露对m BM-MSCs成脂分化功能的影响,并进一步解析砷暴露干预m BM-MSCs成脂分化功能的相关机制。以期在砷暴露致干细胞分化异常的机制研究上取得突破,为砷暴露所致代谢性疾病的机制解析提供新视角。研究方法:通过贴壁分离法获得原代m BM-MSCs。采用细胞活力实验检测NaAsO2暴露对m BM-MSCs细胞毒性的影响。采用DMIRI分化策略对m BM-MSCs进行成脂分化;给予m BM-MSCs 1μM、2μM及3μM砷暴露后,油红O染色判断m BM-MSCs成脂分化能力。利用RT-q PCR技术检测成脂分化关键基因Cebpα、Pparg 1和Pparg 2的m RNA水平来判断成脂分化能力;检测抗氧化关键基因Nrf1、Nrf2、Gclc、Gclm、Nqo1和Hmox1的m RNA水平来判断细胞的抗氧化能力。采用流式细胞术检测1μM NaAsO2暴露对成脂分化早期m BM-MSCs内ROS水平的影响。通过Western-blot技术检测抗氧化蛋白NRF2、GCLC、GCLM和NQO1的蛋白表达水平。结果:1.CCK8细胞活力测试结果显示:当NaAsO2浓度低于7μM时,细胞活力无明显改变;当浓度高于10μM时,细胞活力显著下降（P<0.05）;2.NaAsO2可以引起m BM-MSCs内抗氧化相关转录因子Nrf1、Nrf2及其下游基因表达升高:与对照组相比,1、2或3μM NaAsO2暴露组的抗氧化相关基因Nrf1、Nrf2、Gclc、Nqo1的m RNA水平呈上升趋势,Hmox1的表达随剂量增加而升高（P<0.05）;3.NaAsO2暴露可以抑制m BM-MSCs成脂分化能力:油红结果显示,与DMIRI成脂分化组相比,1、2和3μM NaAsO2暴露组细胞脂滴减少,油红O染色随砷剂量升高逐渐变浅;4.NaAsO2的抑制作用发挥在m BM-MSCs成脂分化早期:在分化初期暴露于1μM NaAsO2的组别,脂滴偏小,油红O定量差异显著（P<0.05）。RT-q PCR检测结果显示,DMIRI诱导分化组的成脂分化相关基因Cebpα、Pparg 1和Pparg 2的表达在36 h后明显升高（P<0.05）。与对照组相比,NaAsO2暴露后Cebpα、Pparg1和Pparg 2于48 h表达水平显著降低（P<0.05）;5.NaAsO2暴露干扰ROS水平进而影响m BM-MSCs成脂分化:ROS水平检测结果显示,1μM NaAsO2暴露组的ROS水平整体呈现下降的趋势,并于24 h降低至50%（P<0.05）。DMIRI诱导分化组的胞质内ROS表达升高,于1 h达到峰值后下降,在24 h达到对照组的1.3倍。与诱导分化组相比,1μM NaAsO2暴露后胞质内ROS的变化趋势相同,但在0-6 h的ROS蓄积量较低（P<0.05）;6.NaAsO2暴露会激活抗氧化基因Nrf2及其下游基因的表达:加入成脂分化培养液处理后DMIRI诱导分化组Nrf2的m RNA水平先升高并于2 h达到峰值随后下降（P<0.05）,Nrf2下游基因Gclc、Gclm、Nqo1和Hmox1的m RNA水平无明显变化。与对照DMIRI诱导分化组相比NaAsO2暴露组Nrf2表达较高,但差异无统计学意义。与对照组相比,NaAsO2暴露组Gclc、Gclm、Nqo1和Hmox1的m RNA表达水平较高（P<0.05）,整体呈现先升高后下降的趋势,并于12 h达到峰值（P<0.05）。在成脂分化过程中细胞内抗氧化蛋白NRF2与GCLC的表达呈现先升高后下降,并于12 h达到峰值（P<0.05）。GCLM蛋白的表达在24 h后持续下降（P<0.05）。NQO1蛋白表达呈先升高后降低的趋势,并于24 h达到峰值（P<0.05）。与对照DMIRI诱导分化组相比,NaAsO2暴露组NRF2表达水平较高（P<0.05）。NQO1蛋白表达在成脂分化早期呈先升高后降低的趋势,并于24 h达到峰值（P<0.05）。与对照DMIRI诱导分化组相比,NaAsO2暴露组NRF2、GCLC及NQO1蛋白表达变化趋势一致,但表达量更高（P<0.05）。GCLM蛋白表达整体较诱导分化组高,且呈现先升高后下降的趋势,并于36 h达到峰值（P<0.05）。结论:1.环境相关剂量NaAsO2暴露可以抑制m BM-MSCs成脂分化能力。2.环境相关剂量NaAsO2在成脂分化早期阶段暴露可以通过激活抗氧化基因Nrf2及其下游基因的表达减少ROS蓄积进而抑制m BM-MSCs向前脂肪祖细胞的定型分化功能。