目的：　　 1.采用高效液相色谱(HPLC)-质谱(MS)联用分析方法对不同产地的高良姜药材样品进行色谱分析,构建整体反映道地高良姜药材化学成分特征的HPLC指纹图谱,并对其特征峰对应的化学成分进行定性、定量,通过相似度评价和系统聚类分析,获得道地高良姜区别于其它不同产地高良姜药材的特征指纹图谱和参数,为道地高良姜药材的质量评价和鉴别提供科学依据。　　 2.采用计算机辅助色谱分离体系优化方法探索高良姜提取物辣味组分的色谱分离条件,并对高良姜中的辣味组分进行分离制备。　　 3.采用HPLC-MS并结合化学鉴别方法对高良姜中的主要化学成分进行初步鉴别和归属。　　 4.探索改善高良姜提取物溶解度的方法,制备高良姜提取物腹腔注射给药制剂。　　 5.对高良姜提取物的镇痛、抗炎、抗菌活性进行评价,探讨辣味组分的分离对其活性的影响,为拓展高良姜的综合利用和特色产品开发提供科学依据。　　 方法：　　 1.高良姜道地药材指纹图谱的构建　　 1.1色谱条件的选择分别对色谱柱、检测波长、流动相、梯度洗脱条件及质谱条件等进行考察,优选出色谱分离度好、灵敏度高、峰纯度高的色谱条件。　　 1.2提取溶剂的选择采用HPLC法比较不同提取溶剂(无水乙醇、70％乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、石油醚)的提取效果,以筛选出最佳提取溶剂。　　 1.3高良姜素含量测定方法学考察取道地高良姜药材供试品溶液,按照优选出的色谱条件,分别对其线性关系、精密度、稳定性、重现性和加样回收率等方法学进行考察。　　 1.4高良姜素含量的测定取道地高良姜药材及不同产地的高良姜药材供试品溶液,按照优选出的色谱条件,分别测定各批样品中高良姜素的含量。　　 1.5指纹图谱方法学考察取道地高良姜药材供试品溶液,按照优选出的色谱条件,分别对精密度、稳定性和重现性等方法学进行考察。　　 1.6指纹图谱的构建取道地高良姜药材及不同产地的高良姜药材供试品溶液,按照优选出的色谱条件,分别对各批样品进行测定,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件及SPSS16.0对各批样品的色谱图进行相似度评价和系统聚类分析。　　 2.高良姜提取物的分离及其化合物的初步鉴别　　 2.1高良姜提取物的分离以相同溶剂体系、不同洗脱强度的多组等梯度薄层色谱(TLC)数据进行计算机辅助色谱行为模拟,优化出高良姜提取物中辣味组分的色谱分离体系,然后采用真空液相色谱(VLC)法分离其中的辣味组分,并通过TLC及HPLC-MS法测定分离效果。　　 2.2高良姜提取物中化合物的初步鉴别采用HPLC-MS、紫外光谱、化学显色及离线TLC-ESI-MS等方法对高良姜提取物中化学成分进行初步鉴别和归属。　　 3.高良姜提取物的活性研究　　 3.1高良姜提取物腹腔注射给药制剂的探索考察不同浓度的PEG400对高良姜提取物的溶解性能和稳定性,以获得高良姜提取物-PEG400腹腔给药制剂。　　 3.2镇痛实验　　 3.2.1热板法筛选痛阈值在5～30s的雌性KM小鼠99只,随机分为11组,9只/组,分别腹腔注射给予高良姜提取物I2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物m2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物Ⅳ2、1、0.5g生药/kg,消炎痛3.25mg/kg,空白对照组给予0.1ml/10g40%PEG,于给药后30min,60min,90min,120min分别测定各小鼠的痛阈值(＞60s,以60s计)。采用t检验,比较组间差异。　　 3.2.2醋酸扭体法取KM小鼠99只,随机分为11组,9只/组,分别腹腔注射给予高良姜提取物I2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物Ⅲ2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物Ⅳ2、1、0.5g生药/kg,消炎痛3.25mg/kg,空白对照组给予0.1ml/10g40%PEG,于给药后30min,腹腔注射0.8%醋酸生理盐水(0.1ml/10g)。记录注射醋酸溶液后20min内各小鼠出现扭体的次数,采用t检验,比较组间差异,并计算药物镇痛抑制率。　　 3.3抗炎实验　　 3.3.1对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响取KM小鼠99只,随机分为11组,9只/组,分别腹腔注射给予高良姜提取物I2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物Ⅲ2、1、0.5g生药/kg,高良姜提取物Ⅳ2、1、0.5g生药/kg,消炎痛3.25mg/kg,空白对照组给予0.1ml/10g40%PEG,给药后30min,于每只小鼠右耳片(两面)均匀涂抹二甲苯0.03ml致炎,立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝(0.1ml/10g)建立炎症小鼠模型,测定各组小鼠耳肿胀度。采用t检验,比较组间差异,并计算药物肿胀抑制率。　　 3.3.2对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响上述实验称重之后,将左右耳片剪碎,浸入2ml丙酮-生理盐水(7:3)的溶液中,在38℃水浴48h条件下浸出染料;离心,上清液于590nm处比色,测定光密度值。采用t检验,比较组间差异。　　 3.4抗菌实验　　 3.4.1抑菌圈的测定分别用无菌棉拭沾取供试菌的菌悬液在MH(或沙保)琼脂平板表面作均匀密集划线,3-5min后用无菌镊子夹取6mm含药滤纸片紧贴于涂菌平板上,以浸有双黄连的滤纸片作为阳性对照,浸有丙酮和无菌水的滤纸片为阴性对照,各3个平行。然后将平板置于37℃,培养24h(白色念珠菌48h),采用游标卡尺测定其抑菌圈的直径。　　 3.4.2 MIC的测定采用液体试管二倍稀释法,将各药液用MH(或沙保)液体培养基连续稀释至第10管,第11管不加药液作为阳性对照,然后分别接种40μl各供试菌液(108CFU3,第12管不加药液和菌液作为阴性对照,各2个平行。置37℃恒温箱中培养24h(白色念珠菌48h),观察各菌的生长情况。以无肉眼可见菌生长的最低药物浓度为该药的最低抑菌浓度(MIC)。　　 3.4.3 MBC的测定将上述未见菌生长各管的培养物混匀后,吸取0.1ml均匀涂布于MH(或沙保)琼脂平板上,各2个平行,置37℃恒温箱中培养24h(白色念珠菌48h),观察结果。以菌落平均数少于5个的最低药物浓度作为该药的最低杀菌浓度(MBC)。　　 结果：　　 1.高良姜道地药材指纹图谱的构建　　 1.1色谱条件色谱柱为岛津C18(250mmx2.0mm,5.0μm);流动相A为0.1%醋酸一水,流动相B为乙腈-甲醇-四氢呋喃(15:40:45);色谱程序为:0～20 min,39%～61%B:20～30min,61%～10%B;30～60min,100%～100%B:0～19min,280nm;19～60min,345nm;流速0.2ml/min,柱温35℃,进样体积5μl。质谱采用电喷雾接口(ESI),探头电压为-4.0kV,偏转电压.50V,离子源温度250℃,氮气流速4.5L/min,负离子扫描,扫描间隔1s,质荷比(m/z)范围60～800。　　 1.2提取溶剂的选择无水乙醇提取液在相同提取条件下的色谱峰响应强度最大、成分最多。因此选择无水乙醇为最佳提取溶剂。　　 1.3高良姜含量测定方法学考察高良姜素在0.10～3.20μg范围内线性关系良好,精密度、稳定性及重现性的RSD分别为2.12%、1.56%、2.55%,高良姜素含量测定平均回收率为100.73%(RSD为2.82%),说明该方法灵敏,可靠,重现性好。　　 1.4高良姜素含量的测定14批次高良姜样品中高良姜素的含量范围为0.59-13.90mg/g。　　 1.5指纹图谱方法学考察在精密度、稳定性及重现性实验中,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均低于3%,符合《中药注射剂指纹图谱的技术要求(暂行)》中的有关规定,适用于高良姜道地药材指纹图谱的建立。　　 1.6指纹图谱的构建确定11个共有峰,建立了12批道地高良姜药材的共有图谱。通过对不同产地高良姜药材指纹图谱进行相似度评价及系统聚类分析,结果表明广西与道地高良姜相似度较高,亲缘关系较近,而海南高良姜与道地高良姜相似度较低,亲缘关系较远,药材品质相差较大。　　 2.高良姜提取物的分离及其化合物的初步鉴别　　 2.1高良姜提取物的分离成功地实现高良姜提取物中辣味组分的分离,TLC及HPLC-MS检测结果表明,辣味组分主要为二苯基庚烷A,其纯度可达85%。　　 2.2高良姜提取物中化合物的初步鉴别高良姜提取物I中主要含有1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮(二苯基庚烷 A)、5-羟基-1-(4-羟苯基)-7-苯基-3-庚酮、二氢高良姜醇、山奈酚、高良姜素-3-甲醚、山奈素-4-甲醚、高良姜素等芳香类化合物,其中辣味提取物Ⅲ中主要含有1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮(二苯基庚烷 A)等二苯基庚烷类化合物,非辣味提取物Ⅳ中主要含有高良姜素等黄酮类化合物。　　 3.高良姜提取物的活性研究　　 3.1高良姜提取物腹腔注射给药制剂的探索40%PEG400为高良姜提取物溶液透亮且稳定的临界浓度,该条件下,高良姜提取物的浓度为43.75mg/ml(相当于0.5g生药/ml),且在常温和4℃冰箱中均可稳定7天,无沉淀析出。选取浓度为40%的PEG400作为高良姜提取物腹腔注射制剂的溶剂。　　 3.2镇痛实验　　 3.2.1热板法高良姜提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ各剂量均能延长小鼠的痛阈值,与空白对照组比较,具有非常显著性差异(P＜0.01和P＜0.05);提取物Ⅲ的高剂量组与消炎痛组比较,具有极显著性作用(P＜0.01)。结果表明,高良姜提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ均具有明显的镇痛作用,其中提取物Ⅲ的镇痛作用较强。　　 3.2.2醋酸扭体法高良姜提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ各剂量均能减少小鼠在20min内的扭体次数,与空白对照组比较,具有极显著性差异(P＜0.01);提取物Ⅰ、Ⅲ的高、中剂量组与消炎痛组比较,具有非常显著性差异(P＜0.01和P＜0.05)。结果表明,高良姜提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ均具有明显的镇痛作用,其中提取物Ⅰ、Ⅲ的镇痛作用较强。　　 3.3抗炎实验　　 3.3.1对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响高良姜提取物Ⅰ、Ⅳ的各剂量均可使小鼠耳肿胀度显著降低,与空白对照组比较,具有非常显著性差异(P＜0.01和P＜0.05);提取物Ⅰ、Ⅳ的高、中剂量组与消炎痛组比较,具有极显著性差异(P＜0.01)。结果表明,高良姜提取物Ⅰ、Ⅳ具有较强的抗炎作用;提取物Ⅲ无明显的作用。　　 3.3.2对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响高良姜提取物Ⅰ、Ⅳ的各剂量均可抑制小鼠皮肤毛细血管通透性,与空白对照组比较,具有非常显著性差异(P＜0.01和P＜0.05),且提取物Ⅳ的高剂量组与消炎痛组相比,有极显著性差异(P＜0.01)。结果表明,高良姜提取物Ⅰ、Ⅳ均具有明显的抗炎作用,其中提取物Ⅳ的作用较强;提取物Ⅲ无明显的作用。　　 3.4抗菌实验　　 3.4.1抑菌圈的测定高良姜提取物Ⅰ、Ⅳ对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有良好的抑制作用,对白色念珠菌的抑制作用较小,对大肠杆菌无明显的抑制作用:提取物Ⅲ对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用,对白色念珠菌和大肠杆菌无明显的抑制作用,即提取物Ⅳ的抑菌作用最强,1次之,Ⅲ最弱。　　 3.4.2 MIC的测定高良姜提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ对大肠杆菌均无作用;对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌及白色念珠菌有不同程度的抑制作用,其中Ⅳ作用最强,对三种菌的MIC为1.562 mg/ml;I次之,对三种菌的MIC为3.125mg/ml,Ⅲ较差,对三种菌的MIC为12.5～50mg/ml;作用均强于双黄连(100mg/ml)。　　 3.4.3 MBC的测定高良姜提取物Ⅳ的杀菌作用最强,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及白色念珠菌等三种菌的MBC为1.562～3.125mg/ml;1次之,对三种菌的MBC为3.125～6.25mg/ml;Ⅲ较差,对三种菌的MBC≥100mg/ml:作用均强于双黄连(400mg/ml)。　　 结论：　　 1.首次采用HPLC-MS法对不同产地的高良姜药材样品进行了分析研究,成功地构建了整体反映道地高良姜药材化学成分特征的HPLC指纹图谱,经相似度评价和系统聚类分析,获得了道地高良姜区别于其它产地高良姜药材的特征指纹图谱和参数,为道地高良姜药材的质量评价和鉴别提供科学依据。　　 2.采用计算机辅助.真空液相色谱法,对高良姜提取物中的辣味组分成功地进行了制备分离,其中的化学成分主要为1-苯基-7-(3-甲氧基-4-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮(二苯基庚烷 A)等二苯基庚烷类化合物;非辣味组分中主要含有高良姜素等黄酮类化合物。　　 3.制备出高良姜提取物-40%PEG400腹腔注射给药制剂。该制剂在常温和4℃冰箱中可稳定7天,在此期间对小鼠无明显的毒副作用,为拓展高良姜提取物的给药途径积累了经验。　　 4.高良姜的镇痛、抗炎、抗菌活性成分主要为黄酮类化合物(提取物Ⅳ),辣味部分(二苯基庚烷类化合物)可分离出来另作特色开发,以拓宽高良姜的用途,使高良姜药用资源得到更全面的开发。