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目的:观察低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在化学诱导的低氧状态下培养的原代鼠胚成骨细胞中的表达变化,并初步探讨在低氧条件下HIF-1α对成骨细胞VEGF表达的影响。方法:1.在无菌条件下取妊娠19天左右的KM胎鼠颅骨,进行原代鼠胚成骨细胞的培养,并用“反复贴壁法”对细胞进行纯化,之后对传代第3代培养的细胞持续计数8天,最后绘制细胞生长曲线,同时对已培养7天的第4代细胞应用钙-钴染色法检测细胞的碱性磷酸酶,进行成骨细胞鉴定。2.取传代第3代培养的成骨细胞,以含125umol/L终浓度氯化钴的DMEM常规培养液培养不同时间,进行化学模拟缺氧状态,对低氧培养的细胞在倒置相差显微镜下观察细胞形态,并对细胞进行计数。将培养不同时间的成骨细胞分别设为0、1、3、5、7天缺氧组。同时,对常氧培养的第3代细胞设0、1、3、5、7天常氧组3.采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测低氧和常氧培养不同时间的成骨细胞HIF-1α和血管内皮生长因子(VEGF)m RNA的表达变化。4.统计学处理:所有的实验都重复三次,实验数据以x±s表示,使用SPSS 12.0软件包进行单因素方差分析,以P<0.05判断为有统计学差异。结果:1.经组织块法培养的成骨细胞,多呈梭形、三角形,有较多突起,部分细长突起常跨越细胞与远处的细胞突起相连接;胞核呈圆形或椭圆形,居中或偏于一侧,轮廓清晰,可见1～3个核仁。从接种后的第1天开始,倒置显微镜下观察,细胞数量扩增较慢,为细胞生长适应期,以后细胞增长加速,第6天达到高峰,以后增长速度逐渐减慢,细胞数量开始下降。第4代培养的细胞碱性磷酸酶钙-钴染色结果显示,细胞质内有黑色颗粒状物质,有少量分散在细胞周围。计数200个细胞,成骨细胞阳性率为95.5% ,阳性细胞多为梭形和鳞片形细胞,符合成骨细胞的生物学特性。2.经氯化钴处理后3天,细胞在形态学上可见细胞膜边界不清,细胞皱缩,胞质致密,核染色质边集;氯化钴处理后7天部分细胞出现凋亡。对氯化钴处理后的细胞进行计数,可见细胞数量于第5天达到高峰,但远低于同一时间的常氧组,之后细胞数量迅速降低。3.反转录聚合酶链反应( RT-PCR)检测各基因的表达变化:通过凝胶成像系统观察并经Lab-work软件分析可见,经氯化钴处理后,HIF-1α和VEGF mRNA的表达随时间的延长逐渐增加(P<0.01),除第0天外,均高于常氧组(P<0.01),而常氧组各时间段则无明显变化(P>0.05);结论:1:通过氯化钴化学模拟低氧状态,可以促使成骨细胞表达大量的HIF-1α。2在低氧条件下,HIF-1α能够诱导成骨细胞增强表达VEGF,从而可能加强局部血管形成,促进成骨细胞的分化,加速骨形成,促进骨创伤的修复。可能也为骨缺血,骨坏死,骨折等疾病的临床VEGF基因治疗提供初步理论探讨。3.改良的组织块培养法结合了传统的组织块法和酶消化法的优点,可在较短时间内获得较多的成骨细胞,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。