月见草素B(OeB)是一种具有多种生物活性的大环二聚体鞣花鞣质,目前已有研究表明OeB在口服进入体内后能发挥多种生理活性。然而OeB在口服进入体内血液前,将经过口腔、咽、食道、胃和小肠等消化道器官,含有一系列人体消化酶以及食源性蛋白质,会对OeB的活性产生一定的影响,同时OeB也会通过影响人的消化酶活力而影响人体的消化吸收。由于OeB是一种大环二聚体鞣质,其结构特点与小分子多酚有较大差异,导致其与蛋白的相互作用过程与小分子多酚并不完全一致。目前针对OeB等低聚鞣花鞣质与消化道内外源蛋白的相互作用还缺乏系统深入的研究。本文借助光谱、微量滴定以及分子模拟的手段,系统地研究了OeB与消化酶以及食源性蛋白的相互作用,揭示OeB口服进入消化系统后与消化道内外源蛋白互作的分子机制,以期为同类大分子多酚与蛋白的相互作用研究提供参考借鉴。本文研究结果如下:(1)OeB在体外模拟消化道中的稳定性研究。通过OeB在不同pH和模拟胃肠液环境下的稳定性实验,发现在OeB在酸性条件下较稳定,pH 2环境下4 h的保留率在96%以上,同时不会受到胃蛋白酶的催化反应影响,产生新的代谢产物,因而推测OeB在模拟胃液中的损失仅与和胃蛋白酶的络合有关;弱碱性条件下OeB前30min保留率在90%以上,但长时间的稳定性较差,pH 7.8下4 h后损失率达42.69%,并有新的物质峰的生成。模拟肠液中OeB代谢物出峰时间与弱碱条件下的一致,且代谢产物的生成率为2%,小于弱碱条件下的生成率4%,表明OeB也不会受到胰蛋白酶的催化作用,并且OeB与胰蛋白酶的相互作用降低了弱碱对OeB的降解,保护了OeB的结构稳定性。总体而言在体外模拟胃肠道环境中,短时间内影响游离OeB状态的主要因素是其与胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用。(2)OeB对胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响。通过测定OeB对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制率和抑制动力学,研究了OeB对两种消化酶活性的影响。结果表明OeB对两种酶的活性均有抑制作用,最高抑制率均在90%以上,胃蛋白酶和胰蛋白酶的半抑制浓度分别为2.66×10~-44 mol/L和1.54×10~-44 mol/L,表明其对胰蛋白酶的抑制效果更强。OeB对胃蛋白酶的抑制类型为竞争性抑制和非竞争性抑制的结合,表明OeB既能与胃蛋白酶的活性位点结合,也能与蛋白底物或酶表面的非活性位点结合,增加OeB与底物的不可接近性,从两方面阻止了胃蛋白酶对底物的酶解。而胰蛋白酶的抑制类型主要为非竞争性抑制,增加了OeB与底物的不可接近性,从而阻止了胰蛋白酶对底物的酶解,使得酶活降低。(3)内外源蛋白对OeB活性的影响。通过96孔板和牛津杯抑菌实验,测定了OeB的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并研究了三种内外源蛋白对OeB抑菌圈大小的影响。结果表明OeB对三株耐四环素金黄色葡萄球菌(SA)均表现出较强的抑菌活性,其中对SA 85号和SA 103号菌株的MIC均为250μg/mL,MBC分别为1000μg/mL和500μg/mL。对86号菌种的MIC为500μg/mL,MBC大于4000μg/mL。牛津杯抑菌实验的结果表明消化道内外源蛋白对OeB的抑菌活性有均一定的抑制作用,随着体系中消化道内外源蛋白浓度的增加,OeB的抑菌圈直径出现了不同程度的下降,在1000μg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和乳铁蛋白浓度下,抑菌圈直径分别减少4.68 mm、10.16 mm和7.40 mm,表明不同蛋白对OeB抑菌活性的抑制效果为胰蛋白酶>乳铁蛋白>胃蛋白酶。(4)OeB与消化道内外源蛋白的相互作用测定。本部分利用荧光光谱(FL)、圆二色谱(CD)、等温滴定量热法(ITC)和分子对接等方法研究了OeB与消化道内外源蛋白的相互作用过程。通过FL发现OeB对消化道内外源蛋白的荧光猝灭均是静态和动态猝灭的相结合的组合,FL数据计算可得OeB对三种蛋白的亲和力大小为乳铁蛋白>胃蛋白酶>胰蛋白酶,在加入OeB后三种蛋白的FL图谱均出现红移,表明OeB的加入使得蛋白的疏水性下降。使用ITC进一步表征OeB与三种蛋白结合的热力学性质,数据表明三蛋白的结合能都随着温度的增加而降低,是一种典型的氢键结合方式,表明在OeB与消化道内外源蛋白在结合过程中释放的能量主要来自氢键,而与乳铁蛋白的结合过程中△H<0,△S>0,证明OeB与乳铁蛋白的相互作用过程中还有静电作用和疏水作用力的参与。CD光谱显示OeB引起三种蛋白展开和松弛的程度不一,其中OeB对胃蛋白酶和乳铁蛋白的影响较小,不同结构的比例变化均在5%内,而胰蛋白酶的影响较大,胰蛋白酶结构中占比约30%的β-折叠结构被转化为α-螺旋结构。分子对接的模拟结果显示OeB与三种蛋白间都存在氢键和疏水作用力,其中与胃蛋白酶的结合点位于其结构域之间的裂缝中,掩盖了其部分活性位点;与胰蛋白酶对接位点在蛋白表面,与其活性位点的氨基酸有氢键结合,但没有掩盖活性位点;与乳铁蛋的结合位点在乳铁蛋白的疏水腔中。(5)OeB与消化道蛋白的相互作用机制。上述研究结果表明三种蛋白与OeB相互作用中都以非共价键作为驱动力,通过疏水作用力进入不同蛋白的疏水腔,并通过氢键与蛋白氨基酸残基结合,进一步增强OeB与蛋白的相互作用。乳铁蛋白中带正电的碱性区域还能与溶液中带负电的游离OeB通过正负离子交换而吸附到了蛋白分子表面,表明静电作用也会参与到OeB与部分带正电蛋白的相互作用过程中。OeB对不同消化道内外源蛋白的亲和力大小顺序为乳铁蛋白>胃蛋白酶>胰蛋白酶,表明随着蛋白的分子量以及疏水性氨基酸含量的增加,蛋白亲与OeB的亲和力也随之上升。OeB对于不同蛋白二级结构影响的程度为胰蛋白酶>>乳铁蛋白>胃蛋白酶,随着OeB浓度的增加,三种蛋白中β折叠中的反平行结构比例均匀不同程度下降,表明OeB的加入对蛋白中的反平行结构的稳定性有一定影响,但OeB对蛋白的亲和力大小与其对蛋白结构的影响程度间没有绝对联系。综合结构变化规律、分子对接和酶活变化的数据,我们推测OeB能通过氢键及疏水作用与消化酶以特定的位点结合,形成比较稳定的复合物,使消化酶的分子的构象发生变化,影响了酶活性中心的构象,从而影响消化酶的生物学功能。酶活的抑制效果与OeB对酶结构的影响程度有关,酶的结构变化越大,酶活受影响的程度也越大。酶活的抑制类型与OeB结合位点有关,若结合位点与酶的活性位点位于同一个疏水腔中,则OeB会对酶的活性位点产生掩盖,从而导致竞争性抑制;若结合位点与酶的活性位点没有发生重合,则不会产生竞争性抑制。总体而言,不同消化酶的结构特点很大程度上影响了OeB对不同酶的抑制效果与机理。