猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2, PCV2)是能够在哺乳动物体内复制的最小病毒,它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。已有的研究分析了PCV2吸附细胞和胞吞的分子机制,但其胞内运输过程尚不明确,病毒能否成功运输决定它下一步能否到达细胞核进行高效复制。有研究报道表明微管和微管相关的分子马达可介导多种病毒的胞内运输活动,因此本研究观察了PCV2感染早期的核靶向运输活动,旨在阐明微管及其分子马达在PCV2胞内运输活动中的功能。1.微管在PCV2感染早期核靶向运输活动中的功能本研究利用激光共聚焦显微镜观察到了PCV2从细胞周边运动到细胞核附近的动态过程。病毒颗粒在感染3h几乎都位于细胞边缘,在感染9h大量弥散在胞浆中并靠近细胞核,在感染12h大量聚集在细胞核周尤其是MTOC处,而在15 h则可检测到病毒蛋白聚集在核内,说明PCV2已完成核靶向运输并成功进入复制转录和翻译阶段。进一步对PCV2感染的细胞图像进行细节放大后可见单个病毒粒子吸附在微管上。通过药物处理破坏微管的聚合功能可以明显抑制病毒的运输效率和病毒的增殖水平。此外,通过分析入侵的PCV2与内涵体的定位关系,发现胞吞进入细胞的PCV2病毒颗粒可被内涵体包裹,这些现象表明PCV2的胞内运输活动是微管依赖性的,并由内涵体囊泡包裹。为了分析PCV2感染对微管聚合功能的影响,本研究使用重组杆状病毒表达的PCV2病毒衣壳蛋白(rBV-Cap)处理细胞并检测α-tubulin的乙酰化水平,发现在rBV-Cap处理的细胞中α-tubulin乙酰化水平上升。在过表达去乙酰化酶6(HDAC6)的细胞中,rBV-Cap蛋白处理对α-tubulin的乙酰化水平影响不大,说明]HDAC6参与调节Cap蛋白诱导α-tubulin发生乙酰化的过程。通过HDAC6活性抑制剂TSA对细胞进行预处理,发现PCV2的感染增殖水平呈现显著提高。这些结果说明,PCV2的感染可以通过促进α-tubulin的乙酰化来增强微管的聚合水平和稳定。2.胞质动力蛋白(cytoplasmic dynein)在PCV2感染早期和中晚期的功能在感染早期,病毒的核靶向运输不仅需要微管更需要分子马达dynein。本研究利用正钒酸钠药物处理细胞来破坏dynein的活性,结果发现病毒的运输效率和增殖效率均呈现显著降低。进一步试验分析了PCV2病毒颗粒在感染早期对dynein复合体各亚基LC8和IC1的募集情况,LC8亚基被多种病毒募集从而劫持分子马达dynein,结果并未发现PCV2感染的细胞中有明显LC8分子聚集,但在PCV2病毒颗粒聚集的部位呈现出IC1亚基特异性的募集。该结果暗示PCV2衣壳Cap蛋白可能具有特异性募集并结合IC1的功能。本研究进一步回答的问题就是PCV2的衣壳蛋白Cap对IC1蛋白的特异性的募集是否具有持续性,推测有两种可能性,一是特异性募集仅发生在感染早期的胞内运输活动,二是不仅病毒粒子可以募集IC1蛋白,在感染增殖过程中表达的Cap蛋白也可以募集IC1。为了进一步分析二者的关系,本研究分析了病毒进入复制转录期后Cap和IC1蛋白的亚细胞定位,结果发现,自感染24 h起,在感染的PK15细胞和3D4/31细胞内,新合成的Cap蛋白出现了入核及逐渐出核的动态定位规律,奇怪的是,胞浆蛋白IC1的亚细胞定位在感染24 h后也出现了入核及逐渐出核的现象。为了确证IC1的异常定位是否由Cap蛋白单一因素引起,本研究通过构建Cap蛋白真核表达质粒转染细胞,证明外源性表达的Cap蛋白也可引起细胞内源性IC1蛋白的异常定位。由于Cap蛋白自身具有核质穿梭功能,本研究继续分析了Cap的核定位信号序列NLS与IC1异常亚细胞定位的关系,结果表明NLS缺失的Cap突变体和IC1蛋白无法入核。为了证明Cap蛋白与IC1共定位是否以复合体形式存在,我们通过GST-pulldown和Co-IP试验证明二者在体外条件、病毒感染和外源性表达的条件下均存在互作关系。通过RNAi的方法对细胞内源性的IC1蛋白的表达进行特异性干扰,发现PCV2的胞内运输效率以及病毒的复制和转录水平都有所降低。说明IC1蛋白在PCV2感染过程中发挥着关键作用。上述数据证明,在感染早期PCV2病毒粒子通过募集胞浆中IC1蛋白以利用细胞运输系统进行核靶向运输,但感染晚期Cap蛋白诱导IC1的入核和出核活动的生物学意义尚不明确。IC1是否在细胞核内是否发挥潜在的生物学功能并参与病毒基因组的复制和转录,本研究尚未得到有力的证明。