家蚕也称桑蚕,是一种重要的经济昆虫,同时也是研究鳞翅目昆虫的重要模式生物。由BmNPV侵染引起的家蚕核型多角体病毒病,给蚕业生产造成巨大的危害和经济损失。病毒入侵会影响家蚕正常的生理代谢,尤其会引起体内多种酶活性发生变化,有研究发现家蚕体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性可能与家蚕的抗性有关,但其活性变化规律尚不明确。金属元素存在于家蚕体内,并伴随家蚕生长发育的各个阶段,金属元素是家蚕体内重要的组成部分,一般来说,生物体内的金属元素按含量的多少主要分为宏量元素和微量元素,大部分的金属元素通过与蛋白结合来参与各项生命活动。因此为了深入研究家蚕体内金属蛋白的结构和功能,对金属蛋白的分离与检测是必不可少的。本文选择对BmNPV具有抗性的家蚕品种及其非抗性非抗性品种作为试验材料,在5龄期对其添食BmNPV病毒,同时设不添食病毒的正常饲养组,通过测定添食病毒后血淋巴和中肠组织中羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性探讨了其活性变化规律,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定了家蚕血淋巴中11种金属的含量,并建立了体积排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术用于家蚕金属蛋白的分离检测。本文的研究结果如下:1.选取具有BmNPV抗性的家蚕品种及其非抗性非抗性品种,在五龄期添食BmNPV病毒,同时设不添食病毒的正常饲养组,而后连续5天取血液和中肠组织,测定其中羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性,探讨了抗性品种及其非抗性非抗性品种家蚕接种BmNPV后体内羧酸酯酶(CarE)和乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的变化规律。结果表明,抗性品种在感染BmNPV病毒后其中肠中羧酸酯酶活性高于未感染的抗性品种,表明抗性品种对感染病毒做出了有效的应答和防御;而在感染病毒后抗性品种的中肠与血淋巴中乙酰胆碱酯酶活性变化相对较小。据此推测,抗性品种在感染病毒后仍保持了相对稳定的代谢过程。2.建立了用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定家蚕血淋巴中Na、Mg、K、Ca、Mn、Co、Ni、Cu、Fe、Zn、Rb等11种金属元素的分析方法。测定四组家蚕(正常抗性品种、添食病毒抗性品种,正常非抗性品种、添食病毒非抗性品种)结果发现,Na、Mg、K、Ca含量较高,达到μg/mL级别,其余元素Mn、Co、Ni、Cu、Fe、Zn和Rb含量较低,在μg/L级别,其中Co含量在1μg/L左右。抗性品种和非抗性品种同一种元素的含量在5天的变化趋势基本一致,抗性品种Mn、Fe、K、Ca、Mg元素的含量在前四天均高于非抗性品种,非抗性品种中Cu元素的含量在后三天高于抗性品种。接种BmNPV病毒后抗性品种和非抗性品种金属含量均发生变化,对于大多数金属而言,抗性品种和非抗性品种变化一致,推测可能是BmNPV病毒的浸染引起的,Cu、Mn、Ni元素在第2天和第4天的变化趋势有所不同,Rb元素在第5天出现不同,推测可能与抗性有关。3.实验中,我们采用SEC-HPLC技术对四组家蚕(BmNPV抗性品种、添食病毒的BmNPV抗性品种,非抗性的品种、添食病毒的非抗性的品种)血液中的金属蛋白进行了分离(流动相为30 mmol/L的Tris-醋酸缓冲液,pH 7.4,进样量50μL,流速0.7 mL/min),然后与ICP-MS技术联用,对家蚕血液内金属蛋白中的金属元素进行了检测。测定表明,家蚕血淋巴中蛋白的出峰时间在8 min~22 min之间。Cu、Fe与大分子量及小分子量的蛋白均有结合,大部分的Zn、Co与出峰时间在12min~20min的蛋白结合,Ni主要与出峰时间在15min~20min的蛋白结合,Rb与大部分的Mg、Ca、Mn主要与出峰时间在20min之后的小分子蛋白结合。对这四组家蚕血淋巴的金属峰进行对比,发现添食病毒后第5天,非抗性品种的家蚕血淋巴在8 min~10 min处出现明显的含Cu金属峰,即出现了大量的大分子含Cu金属蛋白。此外,我们发现对家蚕进行添食病毒第3和第4天,这四组家蚕血液中的含Cu金属蛋白具有很大差异。