达那唑海藻酸钠微球用于子宫动脉栓塞术治疗子宫肌瘤的基础研究研究背景子宫肌瘤是育龄期妇女中最常见的良性肿瘤之一。症状性子宫肌瘤患者目前多采用子宫全切术和子宫肌瘤剔除术治疗。虽然传统的手术治疗临床疗效好，复发率低，但是由于子宫全切术后生育功能的丧失、术后并发症率高等不利因素促使人们探寻新的治疗方法。近年来，一些微创、保留生育功能治疗子宫肌瘤的方法成为研究的热点，其中子宫动脉栓塞（Uterine Arterial Embolization UAE）治疗子宫肌瘤备受瞩目。UAE治疗子宫肌瘤疗效确切，目前已迅速在世界范围内推广和临床应用。UAE治疗中多采用聚乙烯醇、明胶海绵、海藻酸钠微球等血管栓塞剂。载药微球血管栓塞剂虽然尚未应用于UAE，但是它的出现为UAE技术的发展提供了新的方向，它将血管栓塞治疗和药物治疗结合起来，达到双重治疗有望提高UAE的疗效，并具有独特的药物靶向性及缓释特点。海藻酸钠微球是一种天然、可降解的新型血管栓塞剂，已用于子宫肌瘤动脉栓塞的临床治疗。达那唑是治疗子宫肌瘤的药物之一。采用微囊技术将海藻酸钠微球包裹达那唑，制备成一种新型载药微球血管栓塞剂，即达那唑海藻酸钠微球，在子宫动脉栓塞治疗子宫肌瘤的同时，期望通过达那唑局部缓释靶药来增加疗效。达那唑海藻酸钠微球血管栓塞剂的研制开始于2004年，具有独立自主的知识产权，尚未进入临床应用。达那唑海藻酸钠微球用于UAE治疗，国内外暂无相关文献报道。进行达那唑海藻酸钠微球治疗子宫肌瘤的基础研究可为其将来的临床应用提供重要依据。研究目的1．验证达那唑海藻酸钠微球载药量、体外和体内缓释特性；2．建立子宫肌瘤的动物模型，完成达那唑海藻酸钠微球用于治疗子宫肌瘤的基础研究，包括：探讨微球粒径与栓塞效果的关系；论证达那唑海藻酸钠微球在子宫肌瘤动脉栓塞术中的疗效、治疗机制；3．探讨达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞术后，对卵巢功能和妊娠的影响；研究方法1．透射电镜观察达那唑海藻酸钠微球形态及粒径；采用高效液相色谱法，测定达那唑海藻酸钠微球载药量；观察达那唑海藻酸钠微球在体外释放介质中1-28天的药物缓释情况；观察实验动物大耳白兔股动脉带药微球栓塞后的1-14天体内药物缓释情况。2．采用雌孕激素负荷法建立豚鼠和比格犬子宫肌瘤模型，进行解剖学、组织学、影像学验证。3．模拟临床操作流程，行豚鼠／比格犬子宫动脉栓塞术，观察达那唑海藻酸钠微球和海藻酸钠微球的疗效对比；通过解剖学和组织病理学观察、Bcl-2免疫组织化学测定、Tunel法细胞凋亡检测来分析治疗机制。4．模拟临床操作流程，行比格犬子宫动脉栓塞术，通过组织病理学观察，对比粒径100-200gm和300-500gm两种规格的达那唑海藻酸钠微球的栓塞范围和程度。评价主要指标为：子宫坏死总评分和透壁坏死评分。5．模拟临床操作流程，行大耳白兔子宫动脉栓塞术，栓塞术前、术后1月、术后2月、术后3月ElISA法测定血清E₂、FSH、T、LH值来反映达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞术后对卵巢功能的影响；同时在大耳白兔繁育场进行繁育，观察动情期情况、妊娠情况、分娩情况，来初步论证达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞术后对生育功能的影响。研究结果1．达那唑海藻酸钠微球的体外释药第1-7天内释放速率较快，第14-28天的释放曲线基本处于平台期。在28天时间内，微球中的药物累计释放量约40％左右。达那唑海藻酸钠微球体内释药结果显示栓塞后的1-14天体内血清和组织液达那唑药物释放浓度极低（小于最低检测限0.145μg／ml）。2．子宫肌瘤模型豚鼠，如子宫重量，子宫系数、宫颈及宫角最大直径均明显大于正常对照组。HE染色显示其子宫平滑肌层出现局灶性增生．平滑肌排列紊乱细胞增大，符合子宫肌瘤病理组织学改变。研究中2只比格犬肌瘤模型，CT扫描＋强化显示子宫组织内有强化新生占位改变，影像类似子宫肌瘤征像。3．子宫肌瘤模型豚鼠经达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞后子宫重量、子宫系数、宫颈最大直径、宫角最大直径、肌瘤结节数目明显下降或减少。子宫肌层萎缩变薄，子宫内膜中腺体数目减少，腺体萎缩。凋亡细胞比率增高，同时Bcl-2蛋白表达量增高。4．100-200μm达那唑海藻酸钠微球比格犬子宫动脉栓塞后，子宫坏死总评分、透壁坏死评分均高于300-500μm微球。5．达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞术后1月、2月、3月的血清E₂、FSH、LH、T检测值与自身参照的基础值无差异。术后2-10个月间，各月累计妊娠率均低于对照组。尤其是术后2-4月，没有出现妊娠。研究结论达那唑海藻酸钠微球具备载药微球血管栓塞剂稳定缓释的特性，在体外释放表现为快速释放期和平台期，累计释药量随时间增加。动脉栓塞术后体内血清和组织液中释药量低表明目前达那唑海藻酸钠微球用于治疗子宫肌瘤，是以血管栓塞治疗为主，达那唑药物治疗为辅。应用改良的雌孕激素负荷法可建立豚鼠子宫肌瘤模型，比格犬子宫肌瘤模型的建立尚处摸索阶段。动物实验表明达那唑海藻酸钠微球有望成为治疗子宫肌瘤的新型血管栓塞剂，其治疗机制表现为：子宫动脉栓塞后平滑肌组织缺血坏死，微球降解可诱发组织缺血再灌注，造成细胞凋亡增加。微球中达那唑药物的局部释放，增加了子宫平滑肌细胞的凋亡比率。达那唑海藻酸钠微球的粒径是影响子宫动脉栓塞程度和范围的重要因素之一。粒径小的微球容易发生子宫内膜的非靶向栓塞。达那唑海藻酸钠微球子宫动脉栓塞后对动物卵巢功能没有明显影响，栓塞术后实验动物有成功妊娠，但近期受孕和妊娠受到不良影响。