急性心肌缺血是临床上常见的心血管急症,也是造成急性死亡的重要原因,最常见于急性冠脉综合征。然而随着溶栓、冠脉搭桥手术以及冠脉扩张手术等治疗措施的应用,临床上发现缺血心肌恢复血流供应以后,心功能的改善并不能达到预期效果,可见心肌在缺血过程中发生了不可逆的损伤。目前有证据表明,缺血心肌中细胞骨架最早发生不可逆的损伤,如actin在缺血30 min、vinculin在缺血90 min后就会明显减少。本实验室前期研究也提示,内毒素血症大鼠心肌细胞内actin、desmin、tubulin等骨架蛋白含量的减少是导致心肌舒缩功能减低的原因之一。由此可见,心肌细胞骨架蛋白在心肌舒缩功能的调节中发挥了重要作用。对于心肌细胞而言,F-actin既是收缩蛋白也是骨架蛋白,并通过多种肌动蛋白连接蛋白将其定位于心肌细胞膜和心肌细胞Z带上,借以执行心肌收缩舒张功能。α-辅肌动蛋白(a-actinin)就是其中一种连接蛋白,它将肌动蛋白连接成束,传导肌小节之间的机械力,一旦a-actinin出现变化将会直接影响心肌细胞的收缩舒张功能。因此本研究观察了急性心肌缺血与细胞骨架蛋白a-actinin之间的联系,并探索其与心肌细胞功能障碍的关系及可能机制。本实验分两部分。第一部分：实验分为假手术组(sham),缺血30 min组(I30min),缺血60 min组(I60min),缺血60 min再灌注2 h组(IR)。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD)建立急性心肌缺血及再灌注模型,观察心肌缺血对心肌收缩和舒张功能的影响,并通过组织学及免疫组化方法观察心肌组织形态改变和a-actinin分布及含量的变化。综合评价急性冠状动脉左前降支缺血对心肌的损伤作用,探讨a-actinin是否因缺血受到破坏,a-actinin的破坏是否是心肌收缩舒张功能下降的原因之一。并同时用ELISA方法检查心肌组织磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷脂酶C(PLC)含量的变化,观察其在心肌缺血过程中与心肌功能改变和a-actinin含量变化之间的关系。第二部分：我们急性分离大鼠心肌细胞,在细胞水平模拟缺氧条件下初步探讨急性心肌缺氧时a-actinin与F-actin分布、形态和数量的改变,并应用PI3K抑制剂(LY-29400)和PLC抑制剂(U-73122)对缺氧的心肌细胞进行干预,观察这两条激酶途径是否在心肌缺氧时对a-actinin含量及心肌功能产生的影响,从而进一步深入探讨急性心肌缺血时心肌细胞骨架蛋白a-actinin及心功能变化的发生机制。结果：第一部分：(一)急性冠状动脉左前降支缺血再灌注对大鼠心功能的影响不同处理组之间左心室收缩压(LVSP)差异有统计学意义(F=12.799,P=0.000)；随冠脉缺血时间延长,大鼠LVSP逐渐下降；再灌注后部分回升,但仍低于sham组(P=0.001)；从各时间点看,缺血60 min后LVSP最低。I30min组、I60min组、IR组分别与sham组相比,LVSP差异有统计学意义(P值分别为0.001、0.000、0.001)。而I30min组、IR组与I60min组相比,LVSP差异有统计学意义(P值分别为0.033,0.037)。不同处理组之间左心室舒张末压(LVEDP)差异有统计学意义(F=14.965,P=0.000)；随冠脉缺血时间延长,大鼠LVEDP逐渐升高,再灌注后部分回落,但仍高于sham组(P=0.000)。从各时间点看,缺血60 min后LVEDP最高。采用LSD两两比较发现,I30min组、I60min组、IR组分别与sham组相比,LVEDP差异有统计学意义(P值均为0.000)。而I30min组与I60min组相比,LVEDP差异有统计学意义(P=0.037)。不同处理组之间左室内压上升最大速率(+dp/dt max)差异有统计学意义(F=16.532,P=0.000)；随冠脉缺血时间延长,大鼠+dp/dt max逐渐下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham组(P=0.000)。从各时间点看,缺血60 min后+dp/dt max最低。I30min组、I60min组、IR组分别与sham组相比,+dp/dt max差异有统计学意义(P值均为0.000)。不同处理组之间左室内压下降最大速率(-dp/dt max)差异有统计学意义(F=8.995, P=0.000); sham组大鼠-dp/dt max最大,随缺血冠脉时间延长,大鼠-dp/dt max逐渐下降,再灌注后部分回升,但仍低于sham组(P=0.001)。从各时间点看,缺血60 rmin后-dp/dt max最低。I30min组、I60min组、IR组分别与sham组相比,-dp/dt max差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.000、0.001)。(二)缺血心肌组织病理检查结果sham组心肌组织未见明显病理学改变,心肌纤维排列整齐,细胞形态良好,结构完整,横纹清晰；I30min组心肌纤维排列变疏松,心肌间质有红细胞渗出；I60min组部分心肌呈波浪状改变及心肌纤维嗜酸性改变,肌浆嗜伊红性减弱,间质水肿,横纹模糊,心肌纤维断裂,可见游离细胞核；IR组仍可见心肌纤维断裂,膜下空泡,肌浆嗜伊红性同sham组。(三)心肌组织α-actinin免疫组化检测结果以肌纤维中棕黄色或棕褐色为α-actinin阳性表达。α-actinin主要沿心肌Z线呈条带状分布,sham组中α-actinin分布规则,染色均匀,与横纹排列一致。随冠脉缺血时间延长,I30min组、I60min组α-acinin分布不均,出现点状甚至大片缺失。IR组α-acinin染色不均,少量缺失,但灰度值高于缺血组。不同处理组之间α-actinin灰度值差异有统计学意义(F=12.802,P=0.000)。I60min组α-actinin灰度值最低,分别与sham组、I30min组、IR组相比差异有统计学意义(P值分别为0.000、0.024、0.039)。(四)心肌组织PLC含量的检测结果不同处理组之间心肌组织PI3K含量差异有统计学意义(F=10.976, P=0.000)。sham组中PI3K有少量表达。随冠脉缺血时间的延长,心肌组织PI3K含量呈逐渐增加趋势。I60min组分别与sham组和I30min组相比,PI3K含量差异有统计学意义(P值分别为0.000、0.042)。不同处理组之间心肌组织PLC含量差异有统计学意义(F=7.275,P=0.001)。sham组中PLC有少量表达。随冠脉缺血时间的延长,心肌组织PLC含量呈逐渐增加趋势,再灌注后有所下降。I60min组分别与sham组和I30min组相比,PLC含量差异有统计学意义(P值分别为0.001、0.002)；IR组PLC含量与I60min相比差异无统计学意义(P=0.736)。第二部分：(一)以培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量判定心肌细胞损伤程度：缺氧培养对大鼠心肌细胞培养基中LDH漏出量差异有统计学意义(F=10.892, P=0.000)。Control组培养基中LDH含量较低。I60min组、IR组、LY-294002组和U-73122组培养基中LDH含量大大增加,与control组相比差异有统计学意义(P均为0.000)。(二)心肌细胞存活率：不同处理组之间细胞存活率差异有统计学意义(F=42.618,P=0.000)。Control组中心肌细胞存活率最高。I60min组和IR组细胞存活率下降,LY-294002组和U-73122组细胞存活率更低。I60min组、IR组、LY-294002组、U-73122组分别与control组相比细胞存活率差异有统计学意义(P值均为0.000),LY-294002组、U-73122组分别与I60min组相比细胞存活率差差异有统计学意义(P值分别为0.016、0.002)。(三)单个心肌细胞收缩舒张功能：不同处理组之间心肌细胞收缩幅度差异有统计学意义(F=15.893,P=0.000)。Control组中心肌细胞收缩幅度最大。I60min组心肌细胞收缩幅度最低,较control组相比差异有统计学意义(P=0.000)。LY-294002组及U-73122组心肌细胞收缩幅度大大增加,与I60min组相比差异有统计学意义(P值分别为0.000、0.001)；LY-294002组与control组相比心肌细胞收缩幅度差异无统计学意义(P=0.689)。(四)不同刺激对心肌细胞a-actinin荧光强度改变不同处理组之间心肌细胞a-actinin荧光强度差异有统计学意义(F=28.770, P=0.000)。Control组中心肌细胞a-actinin荧光强度最高,I60min组心肌细胞a-actinin荧光强度最低,较control组相比差异有统计学意义(P=0.001)。应用LY-294002及U-73122处理心肌细胞后a-actinin荧光强度较I60min组明显升高(P值均为0.000),但仍低于control组(P值为0.000、0.001)。(五)不同刺激对心肌细胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量的影响不同处理组之间心肌细Ca2+-Mg2+-ATPase含量差异有统计学意义(F=14.668, P=0.000)。Control组中心肌细胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量最高,I60min组心肌细胞Ca2+-Mg2+-ATPase含量最低,与control组相比差异有统计学意义(P=0.000)。应用LY-294002及U-73122处理心肌细胞后Ca2+-Mg2+-ATPase含量较I60min组高(P值均为0.000),但仍低于control组(P值为0.033、0.020)。根据以上实验结果,本研究可以初步得出以下结论：1、在整体水平上,冠状动脉缺血60 min可以引起心肌功能障碍和细胞骨架结构破坏。2、冠状动脉缺血后心肌细胞骨架蛋白a-actinin的变化可能是缺血引起心功能障碍的原因之一。3、冠状动脉缺血后a-actinin的改变可能与细胞内PI3K和PLC的信号通路激活有关。