本研究以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid为载体,以IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ作为候选基因研究其对鹿茸生长的作用机制,针对候选基因各构建三个RNAi重组质粒,分别命名为pshRNA1-1、pshRNAl-2、pshRNA1-3和pshRNA2-1、 pshRNA2-2、pshRNA2-3,转染至软骨细胞及间充质细胞。应用Real-Time PCR和Western blot技术,对转染48h后的RNAi效果进行分析,筛选得到抑制效果最好的干扰组。用于研究目的基因对鹿茸软骨细胞及间充质细胞增殖、凋亡、周期及自身mRNA和蛋白表达的作用,探讨鹿茸生长调节机制。研究内容和结果如下：(1)所构建的三个IGF-Ⅰ RNAi质粒均可显著降低鹿茸软骨细胞及间充质细胞目的基因的表达量。其中,pshRNA1-1、pshRNA1-2. pshRNA1-3分别降低了IGF-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平,且pshRNAl-2的干扰效果最好,对IGF1mRNA的抑制率达到60%以上。(2)所构建的三个IGF-ⅡRNAi质粒均可显著降低鹿茸软骨细胞及间充质细胞目的基因的表达量。其中,pshRNA2-1、pshRNA2-2、pshRNA2-3分别降低IGF-Ⅱ的mRNA表达水平,且pshRNA2-2的干扰效果最好,对IGF2mRNA的抑制率达到60%以上。(3)采用MTT方法检测转染48h细胞的增殖情况,软骨细胞实验组pshRNA1-2和pshRNA2-2、空白对照组、阴性对照组的增殖率分别为16.974-9.83%、19.13±8.11%、24.59±10.22%、22.11-10.19%：间充质细胞实验组、空白对照组、阴性对照组的增殖率分别为22.63±11.22%、23.46±12.77%、29.46±12.88%、28.02±15.69%；结果表明软骨细胞和间充质细胞的增殖均受到抑制。(4)应用V-APC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测转染后软骨细胞的凋亡情况,发现转染48h后,空白对照组、实验组pshRNA1-2、pshRNA2-2和阴性对照组pshRNA-negative的早期凋亡率分别为0.46±0.39%、14.45±3.39%、23.64±2.81%、0.67±0.24%,差异极显著(p<0.01)；间充质细胞转染48h后空白对照组、实验组pshRNA1-2、pshRNA2-2和阴性对照组pshRNA-negative的早期凋亡率分别为4.40±2.05%、25.78±5.87%、38.15±16.66%、6.32±3.03%,差异极显著(p<0.01)。表明转染pshRNAl-2和pshRNA2-2可以促进软骨细胞及间充质细胞凋亡。(5)利用流式细胞仪分析转染后48h碘化吡啶处理的细胞,检测细胞的周期变化情况。结果显示：软骨细胞空白对照组S期比例为12.59±0.04%；试验组pshRNAl-2、 pshRNA2-2为7.19士0.03%、7.12±0.05%;阴性对照组为8.70士0.03%。间充质细胞空白对照组S期比例为9.47±3.56%；实验组pshRNAl-2、pshRNA2-2为4.95±0.48%、3.48±4.74%;阴性对照组为8.284±2.98%。发现无论是在软骨细胞还是间充质细胞中,pshRNAl-2和pshRNA2-2均可使S期细胞减少。结果表明,IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在鹿茸的生长过程中起着重要的调控作用,特别是对鹿茸软骨及间充质细胞的增殖、凋亡有显著的调节作用,其次通过调控软骨及间充质细胞的细胞周期(G1至S期的过渡期)影响其生长发育。此外,对其自身的mRNA和蛋白表达水平的调节有显著影响。