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含有两个或两个以上双键的不饱和脂肪酸为多不饱和脂肪酸(PUFA).国内外实验发现PUFA在体外能杀死肿瘤细胞。根据双键位置的不同,PUFA又可分为ω-3和ω-6两种不饱和脂肪酸。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)是人体必须的营养成分之一,也是参与细胞膜膜磷脂构成和细胞内代谢调控的重要结构脂肪酸。体内外药理学实验证实ω-3PUFA能抑制肿瘤的生长、侵袭及转移,增强某些抗癌药物的疗效,延长荷瘤宿主的生存时间。本课题组也在先前的研究中发现DHA对人胃癌细胞AGS具有显著的增殖抑制作用。co-3PUFA的另一个成员为二十碳五烯酸(EPA),许多体内外实验研究表明其对多种肿瘤具有抑制效应。本课题以一株能较好地代表胆管癌原发灶细胞所有群体的胆管癌细胞FRH-0201为实验模型,旨在研究EPA体外对该细胞株的增殖抑制作用及其机制。1、EPA对人肝胆管癌细胞株FRH-0201增殖的影响MTT法测定结果表明,EPA对FRH-0201细胞作用48小时后,明显抑制FRH-0201细胞增殖,最高抑制率达89.92±0.42%,IC50值为32.20±1.70μg/ml。各处理组细胞在倒置显微镜下观察形态改变明显,细胞开始皱缩,细胞间颗粒增多,死细胞增多。EPA对正常小鼠成纤维细胞L-929无明显抑制作用,不同浓度组间及对照组OD值相比差异无显著性(P>0.05)。台盼蓝拒染细胞数法测定生长曲线,发现EPA各浓度在0到96h间对FRH-0201细胞增殖均有抑制作用,并呈时间依赖性。流式细胞仪检测分析结果表明,FRH-0201细胞经EPA32、50、70μg/ml处理48小时后,其Go/G1期细胞百分比随着EPA浓度的增加而上升,而S期和G2/M期细胞百分比则显著下降。细胞阻滞在Go/G1期。2、EPA体外诱导人肝胆管癌细胞株FRH-0201细胞凋亡的作用吖啶橙染色后,在荧光显微镜下观察,对照组FRH-0201细胞核DNA显黄绿色均匀荧光,EPA各处理组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光,甚至可见浓染的黄绿色碎片,呈现典型的细胞凋亡形态学变化。透射电镜观察FRH-0201细胞的超微结构,发现经EPA40μg/ml处理24h后,胞浆内形成空泡,细胞核染色质发生边集固缩,在核膜周边聚集形成高电子密度的质块,呈现典型的凋亡细胞形态改变。AnnexinV/PI双染法检测凋亡细胞,结果显示,EPA50、70μg/ml作用48小时的细胞凋亡率分别为37.3%和62.2%,明显高于正常对照组(1.3%)。EPA50、70μg/ml作用48小时的晚期凋亡细胞和坏死细胞比例分别为7.0%和7.5%。3、EPA体外诱导FRH-0201细胞凋亡机理的初步研究JC-1染色后,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(△ψm)的变化,结果显示,FRH-0201细胞线粒体△Ψm下降随EPA剂量的增大而显著增多(P<0.05)。FRH-0201细胞经不同浓度EPA作用48小时后,免疫组化法检测其细胞色素c蛋白表达,蛋白阳性的细胞胞浆内出现棕色颗粒。计算机半定量分析结果显示,EPA处理组细胞内棕色颗粒的强弱和阳性细胞的比例明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.001)。Western blot检测了EPA对FRH-0201细胞caspase-3和caspase-9蛋白表达的影响。结果显示,与对照组相比,EPA不同浓度处理FRH-0201细胞24h后,caspase-3和caspase-9蛋白表达显著提高。4、EPA对FRH-0201细胞株SOD、MDA的影响全自动生化分析仪检测FRH-0201细胞内SOD(波长550nm)和MDA(波长532nm)的含量。结果显示,各浓度EPA均能显著或极显著降低细胞的SOD活性(p<0.05；P<0.001),用各浓度EPA处理后,FRH-0201细胞的MDA含量极显著上升(p<0.01；p<0.001)。5、结论EPA对体外培养的FRH-0201细胞有显著的增殖抑制作用,同时对正常小鼠成纤维细胞L-929无明显抑制作用。EPA能使FRH-0201细胞阻滞于Go/G1期,影响细胞周期。并可通过降低线粒体膜电位,释放细胞色素C,激活caspase-9,从而引发caspase-3的级联反应,诱导FRH-0201细胞凋亡